2021 Fiscal Year Research-status Report

肝組織由来スフェロイド（LTOSs）を用いた複合型肝細胞シートの開発

Research Project

Project/Area Number	19K09222
Research Institution	Fukushima Medical University
Principal Investigator	丸橋繁福島県立医科大学, 医学部, 教授 (20362725)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	武藤亮福島県立医科大学, 医学部, 助手 (10791478) 鈴志野聖子福島県立医科大学, 医学部, 助手 (20816376) 石亀輝英福島県立医科大学, 医学部, 講師 (50583358) 清水裕史福島県立医科大学, 医学部, 講師 (70553709) 佐藤直哉福島県立医科大学, 医学部, 助教 (90622332)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	複合型肝細胞シート / 肝組織 / 肝細胞スフェロイド / 肝細胞分離
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、細胞間接着を有した肝細胞スフェロイド；Liver tissue-originate spheroids (LTOSs)を用いた複合型肝細胞シート(LTOSsシート)の開発を行なっている。癌組織由来スフェロイド；Cancer tissue-originated spheroids (CTOSs)の作製方法を応用して作製したLTOSsの3D培養を実施した。これまでの方法では、gentle MACS法を用いて肝細胞を分離し、40μm、100μmのフィルターを用いてLTOSの分離を試みた。ある程度のviabilityをもつ細胞集合体を得ることができ、組織免疫染色では、肝細胞、胆管細胞を含有したLTOSの抽出に成功した。しかしながら、高いviabilityのLTOSsを安定して培養することができず、この原因としてCTOSsとは異なるLTOSs特有の組織不安定性が考えられた。より肝組織に刺激の少ない方法で、よりViabilityの高いLTOSsを作製すべく、我々の講座で行っている肝細胞分離の手法を応用して、全く新しいLTOSsの作製方法を発明し、プロテアーゼの種類や濃度、条件などを変更し、CTOSsと同様の方法で作製したLTOSsよりもViabilityの高いLTOSsを作製することに成功した。さらに、当講座で行っている肝細胞分離の手法を応用して作製したLTOSsの3D培養を実施した。一方、培養1日目よりViabilityの低下を認め、3日以上の培養は困難であった。原因としては、回収したLTOSsに接着している死細胞の影響や、スフェロイドの生存に必要なサイトカインの不足などが挙げられる。そのため、LTOSsに接着している死細胞の割合をより少なくするための分離条件を確立する実験を行っている。また、3D培養下でViabilityを維持するために必要なサイトカインである、HGF、OSMなどの投与量を調整することで、より最適な培養条件を確立する実験を行っている。今後条件を最適化し、3D培養を行うとともに、LTOSの性質について詳細な研究を行う予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 昨年度よりもViabilityの高いスフェロイドを回収することができるようになったが、3D培養下でスフェロイドのViabilityを維持する最適条件を確立できていない。より最適な培養条件を確立するために時間を要している。
Strategy for Future Research Activity	LTOSs作製の手法を最適化し、より高いViabilityを安定して維持できる肝組織を得る。また、安定した培養条件を確立する。また、LTOSsに含まれる複数の細胞を免疫染色により識別し、合成されたタンパク質などの物質をELISA法で定量化して評価することで、成熟した肝組織としての機能を有するLTOSsであることを確認する。安定したLTOSsの培養方法が確立した後は、免疫不全マウスの皮下、肝表面などに移植し、移植片の形態評価、機能評価を行なう。また、疾患モデルマウスへの移植も検討している。
Causes of Carryover	他の研究と同時に行なっているため、効率的な薬剤の使用法、動物の購入などにより経費の節減に努めた。また、2021年度に起こった東北地方の地震による当大学の動物実験研究施設の水漏れ、およびCOVID-19感染拡大による修理工事の遅れにより、実験ができない期間があったため、薬剤および動物の購入数が予定よりも少なかった。来年度は、特殊な培養液やサイトカインなどを使用して3D培養を行う予定であるため、次年度に予算を繰り越した。