補系経路活性化分子は、新たな中隔形成因子の一つとなりうるのか。

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09233
• Research Institution: Asahikawa Medical College
• Principal Investigator: 森 健一郎 旭川医科大学, 医学部, 助教 (70610236)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 3MC症候群 / CL-K1 / CL-L1 / MASP-1/3

Outline of Annual Research Achievements

3MC症候群は、人種・性別に関係なく発病する、心臓病、二分脊椎症、成長不全、知的障害、口蓋口唇裂等の発達異常が特徴である、常染色体劣性遺伝子疾患である。3MC症候群の原因として、自然免疫の補体活性化に関与するCL-K1、CL-L1、MASP-1/3の遺伝子変異が報告された。CL-K1ノックアウトマウスの表現型解析の結果、マウスはヒト3MC症候群と類似した表現型を示すため、マウスをモデル動物として検討を行っている。
本年度は、マウス胎児におけるこれらの遺伝子の発現時期の特定を、リアルタイムPCRを利用して行なった。具体的には、着床前の未受精卵、受精卵、８細胞期、桑実胚、胚盤胞期胚、着床後の胎生7日、11日、15日、17日胚のトータルRNAを利用し、cDNA合成後リアルタイムPCRを行なった。特に、MASP-1/3遺伝子はスプライスバリアントが存在しており、それぞれの遺伝子を特異的に検出するためのプローブを設計した。その結果、①これらの遺伝子が胎生期から発現していること、②胎生期が進むにつれ、発言量が亢進している事が明らかになった。
この結果の意義は、これらの分子が胎生期には自然免疫以外の重要な機能を持つことを、強く示唆したことである。
この結果の重要な点は、本来生体内で自然免疫分子として生体防御に関与するこれらの分子が、子宮、羊膜内で成長する、胎児体内という細菌学的に非常に清潔な領域で、胎生期の初期から発現していることを明らかにしたことである。すなわち、生体内では自然免疫系の補体系路活性化のシグナル下で異物排除に関与する分子が、胎生期では未知の分子と相互作用し、器官形成経路に関与することを示唆する重要な結果である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本来の予定では、リアルタイムPCRでの発現時期の検討を行い発現時期を特定後、 in-situ hybridaizationを利用した遺伝子発現領域の特定と、免疫染色法を利用したタンパク発現組織の特定を行う予定であった。
昨年度、本学の動物実験施設耐震工事に伴うSPF施設の利用制限などにより、マウスをコンベンショナルな環境で飼育維持し、実験に利用しなければならない状況となった。
本研究でターゲットとしている遺伝子は、いずれも自然免疫分子として同定された分子であり、補体系の活性化に関わる分子である。特にCL-K1はノックアウトマウスを利用した検討で、肺炎球菌感染後の生存率の低下が明らかになっている。また、異物感染後の遺伝子発現亢進等の検討結果がないため、これまでの実験は全てSPF環境下での飼育マウスを利用してきた。
そのため、現在のコンベンショナル環境下飼育マウスでは、実験系が統一できないこと、遺伝子発現変化の文献がないこと、SPF環境下以外での飼育マウスを利用した検討はこれまで実施したことがないこと、などの理由で、正確なデータとして扱うことができない。
しかし、コンベンショナル環境下飼育マウスを利用した予備検討は進行しているため、次のSPF環境飼育マウスを利用した遺伝子発現領域と、タンパク発現組織の検討は円滑に進行すると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

現在進行している、コンベンショナルマウスを利用した、in-situ hybridizaion法を利用した発現領域の特定と、タンパクの機能領域の特定の予備検討を引き続き行い、その後、SPFマウスを利用した本検討に速やかに移行する。
当初の計画を早め、心臓中隔形成における情報伝達経路と受容体の解明をマウス胎児を利用して、リアルタイムPCRで進める予定である。
すなわち、CL-K1ノックアウトと野生型の胎生期マウス胚を確保したのち、total RNAからcDNAを作成し、心臓中隔形成に必須であると考えられる転写因子、TBX-5、TBX-1、TVX-20、GATA4、GATA6、NKX2.5、CITED2、IRX4、FOXP1の発現量の変化をリアルタイムPCRで比較検討する。発現量が変化した転写因子が発見できた場合は、上流の伝達経路からCL-LKの受容体の候補となり得るタンパクの検索と行い、候補遺伝子のクローニングを行う。その後、pull-downアッセイなどにより、CL-LKとの相互作用を明らかにすることで、胎生期における自然免疫分子の心臓中核形成における、新たなシグナル伝達経路の発見を試みる。

Causes of Carryover

マウスを実験で利用可能な、SPFレベルでの飼育維持水準で入手が困難であったため、多くの検討をコンジェニック環境下で飼育維持したマウスを利用した予備検討の形で遂行した。
そのため、既存のリアルタイムPCRプローブ、リアルタイムPCR試薬、生化学・分子生物学実験用試薬を利用したため、新規での購入が減少した。
本年度は、SPF環境下飼育維持マウスが円滑に入手可能な状態となるため、申請した昨年度未購入の消耗品等の購入と今年度申請した、一般試薬、生化学・分子生物学実験用試薬、病理・組織学実験試薬、動物実験関連飼育費・購入費リアルタイムPCR試薬・プローブの購入を予定している。