2022 Fiscal Year Research-status Report

補系経路活性化分子は、新たな中隔形成因子の一つとなりうるのか。

Research Project

Project/Area Number	19K09233
Research Institution	Asahikawa Medical College
Principal Investigator	森健一郎旭川医科大学, 医学部, 助教 (70610236)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2024-03-31
Keywords	3MC症候群 / CL-K1 / 自然免疫
Outline of Annual Research Achievements	3MC症候群は、人種・性別非依存性に発病する、心房中隔欠損、心室中隔欠損、二分脊椎症、成長不全、発達障害、口蓋更新列などの症例をきたす常染色体劣勢遺伝子疾患である。報告例に人種、性別、環境などの一貫性がなかったことから、その発病機序が不明であったが、その原因として、自然免疫の補体活性化に関与する２つの遺伝子、CL-K1 (Colectin kidney-1)とMASP-1/3(Mannan-binding lectin serine protease 1/3)の遺伝子変異が報告された。CL-K1 ノックアウトマウスを作成し、その表現型解析を行った結果、CL-K1ノックアウトマウスはヒト3MC症候群と非常に類似する表現型を示したことから、マウスをモデル動物として3MC症候群発病機序解明の検討を行っている。マウスをヒト疾患モデルとしたこれまでの検討で着床前の未受精卵、受精卵、８細胞期胚、桑実胚、胚盤胞期胚、着床後７日胎児、11日胎児、15日胎児、17日胎児からトータルRNAを精製しcDNAを合成後リアルタイムPCRを利用し目的遺伝子であるCL-K1の発現時期の特定はおおよそ終了している。また、CL-K1ノックアウトマウスは野生型マウスと比較し、肺炎球菌感染のリスクが優位に高くなる結果が得られていることから、成体では微生物感染における身体防御の最前線である自然免疫を司る分子として機能していることは明らかであるが、未だにこれら自然免疫分子が胎児期に器官形成においてどの様に機能しているかは不明である。胎生期に生体防御因子である、自然免疫分子の発現が認められたことは非常に重要な意味を持つと考えられる。すなわち、母獣子宮の羊膜内で成長する、胎児という細菌学的に非常に清潔な領域で、異物排除に機能すると考えられていた分子が、未知の機能を持つことを意味するからである。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 自然免疫分子であるCL-K1、MASP-1の胎生期ので発現時期と発現臓器を明らかにするため、CL-K1、MASP-1の遺伝子発現をin-situ hybridizationと免疫染色で明らかにする予定であった。その予備検討として、コンベンショナル条件で飼育されたマウスの着床前の未受精卵、受精卵、８細胞期胚、桑実胚、胚盤胞期胚、着床後７日胎児、11日胎児、15日胎児、17日胎児からトータルRNAを精製しcDNAを合成後リアルタイムPCRを利用し目的遺伝子であるCL-K1、MASP-1の発現時期の特定は既に終了していた。この予備検討の結果をもとに、SPF条件下で飼育されたマウスを利用し上記の発現時期と発現臓器の特定を免疫染色等の手法を用いて行う予定であったが、本年度は申請者が病気療養をしなければならない状況となったため、課題に対する進捗状況は遅れいている。
Strategy for Future Research Activity	疾患原因遺伝子であるCL-K1、MASP-1の胎生期での発現時期を in-situ hybridizationで明らかにし、発現臓器を胎児免疫染色法で明らかにする予定である。さらに自然免疫分子CL-K1が心房中隔、心室中隔形成にどのように関与するかを明らかにする予定である。すなわち、胎生期に分泌タンパク質であるCL-K1がどのような受容体に結合するか、もしくは相互作用するかを明らかにすることで、未知の心房中隔、心室中隔形成経路を発見することを目的としている。具体的には、CL-K1野生型マウスとノックアウトマウスの胎児を利用し、心房中隔、心室中隔に必須であると考えられている転写因子、TBX-5、TBX-1、TVX-20、GATA4、GATA6、NKX2.5、CITED2、IRX4、FOXP1遺伝子の発現量変化をリアルタイムPCRで比較検討を行う。発現量が変化した転写因子を見つけた場合、その上流の経路からCL-K1の受容体もしくは相互作用分子の候補となりうるタンパク質の検索を行い、候補遺伝子のクローニングを行う。その後、pull-down アッセイなどによりCL-K1との相互作用を明らかにし、胎生期における自然免疫分子の心房中隔、心室中隔形成における、新たなシグナル伝達経路の発見を試みる。
Causes of Carryover	本年度は長期の病気休職があり、大幅な研究の遅れが発生したため、次年度使用額が発生した。復職後は、研究遂行に必要な、リアルタイムPCRプローブ、リアルタイムPCR用試薬、生化学・分子生物学実験用試薬、一般試薬、病理・組織学実験試薬、動物実験関連飼育費、動物購入費、学会発表などに使用予定である。