脂肪幹細胞由来神経細胞による胸腹部大動脈術後虚血性対麻痺に対する新規治療法の開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09248
• Research Institution: University of the Ryukyus
• Principal Investigator: 清水 雄介 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10327570)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 神里 興太 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10554454) ; 角南 寛 琉球大学, 医学部, 特命助教 (50374723)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 脂肪幹細胞 / 神経細胞 / 脊髄虚血後痙性麻痺

Outline of Annual Research Achievements

本研究は１）脂肪幹細胞採取　２）脂肪幹細胞から神経細胞への誘導、３）ラット脊髄虚血後痙性麻痺モデルに対する脂肪幹細胞由来神経細胞移植、という3つの計画を軸としている。本年度はまず１）「脂肪幹細胞採取」のためにラットより脂肪を採取し、そこから脂肪幹細胞の抽出と培養を実施し、問題なく遂行できた。２）「脂肪幹細胞から神経細胞への誘導」については、既存の報告を基に神経細胞への誘導を検討したが分化を確認できなかった。今後は、肝細胞成長因子・上皮細胞成長因子・塩基性線維芽細胞成長因子を混合した培地で分化に成功した報告があることより、新たな分化の方法を検討中である。３）「ラット脊髄虚血後痙性麻痺モデルに対する脂肪幹細胞由来神経幹細胞移植」についは、まずラット脂肪幹細胞を野生型SD系ラット脊髄に移植した。移植に際してこれまでヒト胚性幹細胞由来神経幹細胞移植時よりも免疫抑制剤使用量を減じて軟膜下細胞移植を行った。移植手技に関して問題はなく、スムーズな軟膜下細胞移植を実施できた。しかし、FK506+MMF+ステロイドによる低容量免疫抑制で、移植した脂肪幹細胞を蛍光免疫染色において確認することはできなかった。今後は、これまでのヒト由来細胞の移植使用した免疫抑制剤を使用し移植を行うこと（免疫抑制の強化）。免疫不全ラットを用いた移植細胞の確認を行うこと（拒絶しない系を使用）。移植する幹細胞への緑色蛍光タンパクによるラベリング（移植した細胞群の確実な確認）等をそれぞれ実施する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は１）脂肪幹細胞採取　２）脂肪幹細胞から神経細胞への誘導、３）ラット脊髄虚血後痙性麻痺モデルに対する脂肪幹細胞由来神経細胞移植、という3つの計画を軸としている。本年度は１）「脂肪幹細胞採取」のためにラットより脂肪を採取し、そこから脂肪幹細胞の抽出と培養を実施し、問題なく遂行できた。２）「脂肪幹細胞から神経細胞への誘導」については、誘導を確認できなかったが、実験系の検討は重ねている。３）「ラット脊髄虚血後痙性麻痺モデルに対する脂肪幹細胞由来神経幹細胞移植」については、予備実験としてラット脂肪幹細胞を野生型SD系ラット脊髄に移植できた。移植手技に関して問題はなく、スムーズな軟膜下細胞移植を実施できた。以上のように概ね順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

SD系ラットからの脂肪幹細胞の採取・培養に関しては問題なく実施できている。また、手術としてラット脊髄虚血モデル作成およびラット軟膜下細胞移植に関しても手技的な問題は生じておらず、このまま検討を継続して問題はない。
２）「脂肪幹細胞から神経細胞への誘導」に関して、これまでの分化に成功できたという報告から脂肪幹細胞を神経幹細胞へ分化させる試みを行ったが分化の確認が行えなかった。新たな分化手法を実施する予定である。脂肪幹細胞が肝細胞増殖因子等の保護因子を分泌するという報告もあり、脂肪幹細胞の神経保護作用に関しても検討する予定である。
３）「ラット脊髄虚血後痙性麻痺モデルに対する脂肪幹細胞由来神経細胞移植」に関して、有害作用が大きい免疫抑制剤の使用量を減じた。しかし、本年度の脂肪幹細胞移植において細胞の生着が確認できなかったのは、免疫抑制が不足した結果、拒絶が起こった可能性が挙げられる。今後は（１）免疫抑制剤の増量、（２）免疫不全ラットの使用により拒絶の可能性に関して検討を進める。また脂肪幹細胞の分化が生じた可能性を確認するため、（３）緑色蛍光タンパクの導入を行い、蛍光免疫染色における確実な細胞確認を実施する。免疫抑制剤の増量により細胞の生存が確認できた場合、細胞が生存できる免疫抑制の最少投与量を探索する。これは脊髄虚血モデルの作成自体が大侵襲な手技であるため、細胞移植手術後の個体生存率を保持するためである。

Causes of Carryover

（理由）本研究において購入した試薬類が想定よりも安価であったため。
（使用計画）令和２年度に行う動物実験モデルの購入費用、試薬類に使用する。