胚葉間の相互作用を意識した、ヒトiPS細胞由来の肺類器官(肺様体)培養法の開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09299
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 舟橋 淳一 東北大学, 加齢医学研究所, 准教授 (00270827)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: iPS細胞 / 中胚葉 / 内胚葉 / 分化誘導

Outline of Annual Research Achievements

iPS細胞から様々な臓器を作り出そうという試みは多い。しかし未だ機能する肺を作れたという報告はない。実はこれらの研究には、臓器構築には内胚葉由来の内皮細胞だけでなく、中胚葉由来の組織(間充織)も必要であるという観点が欠落している。正常な肺の発生過程では、内皮細胞層と間充織が相互作用することで、細胞の分化と組織の形態形成を進めている。そこでiPS細胞から中胚葉へと分化誘導した細胞を、同じくiPS細胞由来の内胚葉の細胞と共培養して、より高度に組織化され且つ新生児肺に近い組織構築を目指し、研究を進めた。
今年度は、すでにの再現性の確認できた米国のグループからの肺様体の作製法の報告《Dye, B.R. et al. eLife 4, e05098 (2015) 》とはやや異なる、より効率の良い肺様体の作製法の報告《Chen, Y.-W. et al. Nature Cell Biology 19, 542-549 (2017)》《Magro-Lopez, E. et al. Stem Cell Research & Therapy, 9, 186 (2018)》の再現性を確かめた。肺は内胚葉由来で前腸の腹側に生じる分枝から形成される。そこで、まず iPS 細胞を分化誘導するため、低吸着・低酸素条件で BMP4 と Wnt3a で処理、続いて Activin を加えて内胚葉へと誘導した。生じた細胞塊をいったん解離して、接着条件で Noggin と SB431542 などで前腸内胚葉へと誘導した。この細胞シートを再び解離させ、低吸着条件でFGF10, FGF7, BMP4 などを加えて前腸腹側へと誘導して、ある程度まで大きくなった organoid をマトリゲルに包埋して分岐の誘導を試みたが、これまでのところ十分な分岐が得られていない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

今年度は、すでにの再現性の確認できた米国のグループからの肺様体の作製法の報告《Dye, B.R. et al. eLife 4, e05098 (2015) 》とはやや異なる、より効率の良い肺様体の作製法の報告《Chen, Y.-W. et al. Nature Cell Biology 19, 542-549 (2017)》《Magro-Lopez, E. et al. Stem Cell Research & Therapy, 9, 186 (2018)》の再現性を確かめた。
肺は内胚葉由来で前腸の腹側に生じる分枝から形成される。そこで、まず iPS 細胞を内胚葉へと分化形質を誘導するため、低吸着ディッシュ上で低酸素濃度培養し、初日はRoc 阻害剤と BMP4, Wnt3a で処理、以降 4日目まで Activin-A, Roc 阻害剤, FGF2 と BMP4 で処理した。生じた細胞塊をいったんトリプシン処理して fibronectin をコートしたディッシュ上で BMP/TGFβアンタゴニストである Noggin と SB431542 で24時間処理し、続いて IWP と SB431542 で24時間処理して前腸腹側の分化形質を誘導した。この細胞シートを酵素処理で再び解離させ、低吸着ディッシュでFGF10, FGF7, BMP4 などを加えて20日程度培養した後、Matrigel 中に包埋し、培養を続けることで lung organoid (肺様体)の誘導を試みたが、十分な分岐が得られていない。細胞シートを解離させる段階で、単細胞にはせずに数個の細胞塊の状態で留めることが求められているが、その制御が困難であるため、進捗に遅れが生じている。

Strategy for Future Research Activity

各段階での分化状態を確認するため、種々の分化マーカーの発現を免疫組織化学的あるいは分子生物学的に調べて、改良点を探る。また細胞シートを解離する前の細胞シートの細胞密度や、解離する際の酵素の反応時間を数段階に変化させて、より効率の良い条件を探る。
一方、iPS細胞から中胚葉を誘導することに関しては、最近になって効率の良い分化誘導培地が市販されるようになったので、これを利用する。

Causes of Carryover

年度末近くに新たに分化誘導培地の購入を予定していたが、COVID-19対応のため実質的に実験ができなくなったため、次年度に購入するよう執行計画を変更したため。