抗炎症関連分子Spred2に着目したマウスモデルによる移植肺機能温存法の開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09306
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 山根 正修 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (20432643)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 豊岡 伸一 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (30397880) ; 松川 昭博 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (90264283)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 肺障害 / 虚血再灌流 / MAPキナーゼ / Spred２ / 肺移植

Outline of Annual Research Achievements

【実験動物の維持、手技の安定化】
マウスの基本的な取り扱いを定着させ、遺伝子タイプの同定のためRT－PCR手技を実施した。本研究の急性肺障害（虚血再灌流モデル）モデル作成のためワイルドタイプマウスを用いて実験手術手技を安定させた。全身麻酔を導入し開胸後にクリップを用いて肺門部をクランプし、その後に再灌流を行い障害肺モデルの作成を行った。障害の程度はH-E染色による病理組織による評価を行った。
【ノックアウト、トランスジェニックマウスによる予備実験】
手技の安定の評価のため動脈血ガス分析の測定、作成した障害肺を行った。次にSpred２ノックアウトマウスとSpred2遺伝子過剰発現マウスであるトランスジェニックマウスを用いて同様に開胸、クランプモデルによる肺障害実験を行った。それぞれRT－PCR、H-E染色による組織像、動脈ガス分析を施行し予備実験として評価した。Spred2抗体が入手された後にウェスタンブロッティングを施行、トランスジェニックマウスにおけるSpred２タンパクの発現の確認を行った。また組織特異的Spred2欠損マウスの開発により実験可能な状況となった。
【現時点の結果】
Spred2遺伝子過剰発現マウスにおいてH-E染色、動脈血酸素分圧測定では差は認められなかった。このことは抗マウスSPRED2抗体を用いて発現量をウェスタンブロッティング法にて確認したが予備実験では差が認められなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

【実験動物の開発、実験モデルの作成】実験動物の取り扱いが安定し、必要なマウスの供給とＲＴ－ＰＣＲにより遺伝子タイプが評価できるようになった。肺虚血再灌流障害モデルの作成が安定し、さらにトランスジェニックマウス（肺虚血再灌流障害モデル）、コンディショナルノックアウトマウス（Spred2遺伝子改変マウス）が使用可能な状況に進展した。
抗Spred2抗体が入手できるようになり、Spred2遺伝子過剰発現マウス、障害肺でのSpred2発現の評価が可能となった。

Strategy for Future Research Activity

異系移植（慢性拒絶であるBOS、Bronchiolitis Obliterans　Syndromeモデルの異所性および同所性気管移植）を作成する。同時に複数の気管を皮下に移植することにより拒絶判定の評価が推進されるようにする。
また開発されたトランスジェニックマウス、組織特異的Spred2欠損マウスを用いてSpred２の慢性拒絶における役割を明らかにする。
抗Spred2抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果からは正常マウスとトランスジェニックマウスとのSpred2タンパクに発現量に差が認められなかった。障害の程度の違いかマウスモデル、あるいは抗体の特異度に違いがある可能性もあり、今後は障害の強い肺検体、肺以外の臓器の検体を用いて抗体の精度を検定する。
また強い肺障害後の拒絶反応の関与について上記の皮下移植モデルを用いて検討をすすめる。

Causes of Carryover

2－3月に予定していた実験が一部未実施となったため翌年度実施可能な体制になり次第、消耗品を購入し研究を推進する。