胸膜中皮腫に対する胸腔内局所療法の開発と新規バイオマーカーの探索

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09311
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 塩見 和 北里大学, 医学部, 講師 (50398682)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 江島 耕二 北里大学, 医学部, 准教授 (30327324) ; 小寺 義男 北里大学, 理学部, 教授 (60265733)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 中皮腫 / 胸膜中皮腫 / 胸腔内治療 / バイオマーカー / 免疫療法

Outline of Annual Research Achievements

胸膜中皮腫の予後を改善する新しい治療戦略の開発を目指し、①低侵襲かつ局所制御効果の高い胸腔内局所療法の開発と、②中皮腫の中でも難治性症例に対する新規バイオマーカーの開発を目的とした基礎研究を行っている。
①胸腔内局所療法に関しては、これまでに作製したマウス中皮腫胸腔内及び皮下モデル（BALB/c及びC57BL/6Jのマウスにマウス中皮腫細胞株（AB12及びAE17）を移植させたもの）を用いている。抗癌剤（小分子化合物）に関しては徐放効果を目的とし、免疫担当細胞に関しては胸腔内での安定性を高めるために、ゲル（アルギン酸ナトリウム塩化カルシウムゲル、ヒアルロン酸ゲル、ゼラチン）を用いて検討中である。また、胸腔内に注入する免疫担当細胞に関しては、所属リンパ節内リンパ球および腫瘍浸潤リンパ球の効率的な培養法を探っている。さらに、上記モデルを用いた腫瘍根治免疫メカニズムの解明実験に関しては、共通抗原の存在も含めて、異なる数種類の細胞株でも同様に再根治が得られるか検討中である。
②難治性組織型症例に対する新規バイオマーカーの開発に関しては、ヒト中皮腫組織のパラフィン切片を用いたショットガンプロテオミックス法（プロテオーム解析）を行った。難治性の組織型（二相型、肉腫型）と正常中皮細胞及び中皮腫（上皮型）との比較で発現に差のあるタンパク質として、FKBP10 (FK506 Binding Protein 10)、HDLBP (High Density Lipoprotein Binding Protein)、MAP4 (Microtubule Associated Protein 4)、LIMA1(LIM Domain And Actin Binding 1)を選択した。これらのタンパク質に関して、抗体を購入して免疫組織染色を行い、有用性を検討中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

①胸腔内局所療法の実験に関しては、Gemcitabine（抗癌剤、小分子化合物）の徐放効果を正確に評価するため、HPLC（高速液体クロマトグラフィー）を用いて、マウス血中のGemcitabine濃度測定系確立のための実験を開始した。また、免疫担当細胞の胸腔内注入実験に関しては、AB12をBALB/cの足底に移植し、2週間後に腫大した膝窩リンパ節を小片に切り、培養した。リンパ球と樹状細胞のコロニーの生成を期待したが、骨髄系ではなく上皮系の細胞のコロニーが形成された。従って、現在は、AB12腫瘍を切除、摘出し、セルソーターを用いて腫瘍浸潤CD8+細胞を分取、これをIL-2、抗CD3の抗体、抗PD-1抗体の存在下で抗原刺激を加えながら、培養、増殖させる実験を行っている。また、腫瘍根治免疫メカニズムの解明実験に関しては、種々の細胞株における共通抗原の存在の可能性を考え、マイトマイシン処理をしたAB12を移植後に、CT26（BALB/c、大腸癌細胞株）の増殖をみた。結果はコントロールと比較し、CT26の増殖抑制が明らかに認められた。現在、細胞株を増やし、同様の傾向が認められるか検討中である。
②難治性の組織型である二相型、肉腫型に対するバイオマーカーの探索実験に関しては、FKBP10 、HDLBPに対する抗体を購入し、中皮腫組織検体（上皮型、二相型、肉腫型）および中皮細胞セルブロック（胸水より作製）の免疫組織染色を施行した。FKBP10に関しては、非特異的な染色が認められた。HDLBPに関しては、上皮様及び紡錘形の腫瘍細胞に強く、その他の正常細胞に弱い発現 が認められた。しかし、中皮細胞もでも中等度の発現が認められた。

Strategy for Future Research Activity

①胸腔内局所療法の実験に関しては、まずは、HPLC（高速液体クロマトグラフィー）を用いたマウス血中のGemcitabine濃度測定系の確立を行う。また、同時に、腫瘍浸潤CD8+T細胞の効率的な培養法の確立を行う。その後に、AB12を胸腔内に移植したマウスモデルの胸腔内に、種々のゲルや細胞の足場素材としてRCP petaloid μ-pieceを用いて、Gemcitabineおよびリンパ球を投与し、予後、血中濃度を観察する。
②難治性の組織型である二相型、肉腫型に対するバイオマーカーの探索実験に関しては、MAP4 (Microtubule Associated Protein 4)に対する抗体を購入し、中皮腫組織および中皮細胞セルブロックを用いて、免疫組織染色を行う。また、同時に、多施設での中皮腫検体の集積に努める。

Causes of Carryover

難治性組織型症例に対する新規バイオマーカーの開発において、4つのタンパク質（FKBP10、HDLBP、MAP4、LIMA1）の発現について、ヒトの中皮腫と正常中皮を免疫組織染色で比較した。まずは小容量の抗体を購入し、条件を検討した後にすべての検体が染色可能な容量の抗体を購入する予定であった。しかし、非特異的な反応が出るなど、条件検討に時間を要したため、その購入予定費用が次年度使用額として生じた。次年度では、条件検討の継続もしくは別のタンパクを選択して免疫染色の抗体の購入に充てる予定である。