2019 Fiscal Year Research-status Report
脳死関連肺障害の病態解明と予防・治療法の開発ー特にNPYとVEGFと関連して
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19K09325
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
西脇 公俊 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (10189326)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 神経原生肺水腫 / 細胞透過性 / 神経ペプチドY / 気管支上皮細胞 / THP-1由来マクロファージ細胞 / 脳死肺移植 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者は、ラット神経付き肺潅流標本およびラットフィブリン誘発神経原性肺水腫モデルを用いた検討において、肺交感神経終末でカテコールアミンと共存する神経ペプチドY（NPY）による神経性調節が細胞透過性に関与することを明らかにした。しかしながら、NPYの作用機序については未だ不明なままである。本研究の目的は、in vitro肺細胞透過性評価系を確立し、NPYの作用機序を細胞レベルで明らかにすることである。
研究代表者はこれまでに、ヒト正常肺微小血管内皮細胞（HMVEC-L）とヒト気管支上皮細胞株（Calu-3）を用いた、2つのin vitro細胞透過性亢進作用アッセイ系を確立し、NPYの作用を検討してきた。両方のアッセイ系において、1 × 10-7 MのNPYは細胞透過性に影響を及ぼさなかった。しかしながら、ヒト単球細胞株THP-1細胞を分化処理したマクロファージモデル細胞に1 × 10-8 MのNPYを添加し、6時間培養した後の培養上清は、Calu-3アッセイ系で有意な細胞透過性亢進作用を示した。本年度は、Calu-3とTHP-1由来マクロファージモデル細胞を共培養するアッセイ系の構築を試みた。さらに、細胞透過性亢進作用に寄与するタイトジャンクション蛋白の検出に用いる抗体選定を行った。
Calu-3細胞単層上に、細胞数がCalu-3の約1/3になるようにマクロファージ様細胞を播種する系を作製した。しかしながら、選定したタイトジャンクション蛋白のOccludinやZo-1の抗体を用いた細胞溶解物のウェスタンブロッティングにおいて、Calu-3とマクロファージ様細胞の両方に蛋白発現が見られること（発現量はCalu-3＞マクロファージ様細胞）、共培養サンプルで検出される蛋白発現量にバラツキが見られることが判明した。このことから、本共培養系を用いて各種解析を行うことを断念した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究代表者が新たに構築したCalu-3とTHP-1由来マクロファージモデル細胞を共培養するアッセイ系が、NPYの生化学的なメカニズム解析に不適であると判断したことから、細胞透過性亢進作用の評価にも用いることができなくなった。そのため、より実際の肺環境に近いin vitroアッセイ系の構築がスタートに戻る状況となり、進捗はやや遅れている。
上記に加え、当初の優先検討課題であった「脳死モデルでの神経原生肺水腫に関わるneuropeptidesの同定とVEGFの関与」についても検討を進めているが、マウス脳死モデル作製方法、肺水腫評価法、および肺水腫液と血清中の蛋白質比測定法など、全てが検討途中段階にある。
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| Strategy for Future Research Activity |
肺上皮細胞、マクロファージ細胞、肺微小血管内皮細胞の3つの細胞を共培養系するin vivo肺モデル作製のための検討を引き続き行う。共培養系とは別に、NPY添加したマクロファージモデル細胞の培養上清をCalu-3アッセイ系に添加することで細胞透過性亢進作用が観察されることはすでに確認できている。しかしながら、マクロファージ様細胞に関しては、使用する培地、細胞播種密度、細胞培養期間など、検討必要事項が複数残っている。これらの検討項目を解決した上で、NPYの細胞透過性亢進作用の再評価ならびにNPYのメカニズム解析を行う。
また、in vivoの検討課題「脳死モデルでの神経原生肺水腫に関わるneuropeptidesの同定とVEGFの関与」では、マウス脳死モデルの早期の確立を目指す。具体的には、マウス頭蓋内に血栓除去用カテーテルを挿入し、バルーンを用いて頭蓋内圧を上昇させ、脳幹部にヘルニアを起こすことにより脳死モデルを作製する。血液ガス分析による肺障害の重症度解析、摘出肺のWet/Dry Ratioの測定、血中、気管支肺胞洗浄液中および肺組織中の神経ペプチド同定を可能にし、神経原生肺水腫を抑制できる薬物の評価系を作製する。
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