2019 Fiscal Year Research-status Report

Investigation of mechanisms of neuropathic pain using compartment culture

Research Project

Project/Area Number	19K09379
Research Institution	Kyoto Prefectural University of Medicine
Principal Investigator	柴崎雅志京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (20405319)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	神経障害性疼痛 / コンパートメントカルチャー / マイクログリア
Outline of Annual Research Achievements	神経障害性疼痛の原因は多岐にわたるが、それは生体内での多種類の細胞や物質が複雑に相互作用により出現しているため、一元的にそのメカニズムを解明することは困難である。その解析を進めていくためには、in vitro, in vivoの両方からのアプローチが必須である。本研究ではin vitroの解析の一環として、マウスの後根神経節を回収し、既製品のチャンバーを用いて区域培養を行い、軸索を独立して獲得することによって生化学的な変化を確認することを目的としている。そのためには区域培養を適切に行い、十分な量の軸索を獲得することが必要である。本研究では実験の出発点として区域培養が必要となっているが、従来型の区域培養を施行した際、大人マウスでは回収できる軸索がごく少量であり、ガスクロマトグラフィーを施行するには十分でないことが発覚した。本研究の性質上、大人マウスを使用することが必須であり、まずはより多くの軸索を回収できるようにチャンバーを改良する必要性に迫られている。区域培養に使用するチャンバーはテフロンを使用した個別生産であり、特注して試用するには時間もコストも膨大となってしまうため、低コストで大量のプロトタイプを作成するための方法として３Dプリンターに注目した。プロトタイプ作成の前段階として、PLAがテフロンと比較して神経細胞に大きな影響を与えないことを証明する必要があり、現在は軸索の伸長の違いについて両者の比較検討をしている段階である。比較検討が終わり、安全性が証明されたら、軸索を回収するのに最適なチャンバーを作成し、改めてガスクロマトグラフィーに進む予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本研究において、区域培養を行い十分な量の軸索を回収することが必須であるが、従来型のチャンバーを用いた方法ではガスクロマトグラフィーをするのに十分なタンパク質が得られないため、チャンバーの改良を行う必要がある。改良を行うにはいくつかプロトタイプを作成しなければならないが、従来型のテフロンを用いたチャンバーを毎回特注していては、時間もコストも多く必要となり、問題点が発覚しても調整しにくくなってしまう。そのため、低コストで微調整も簡単な３Dプリンターが向いていると考えられる。以上より３Dプリンターを用いて、PLA素材のプロトタイプを作成することとした。ただし、PLAはbiosafeとは言われているものの、神経細胞に与える影響が未知数であり、それを無視して実験を継続した場合、実験に対する信頼性自体が揺らぐ可能性がある。一般に２つの実験系で全く差がないことを証明することは困難であるが、最低限健常の大人マウスや胎児マウスにおいて、軸索の伸長に明らかな変化を与えないことを証明し、安全に使用できることを証明する必要がある。現在は従来型と同じ形状のPLA製プロトタイプのチャンバーを作成し、PLAの安全性の証明のために、従来型とプロトタイプの両者について軸索の伸長を確認し、比較検討しているところである。両群ともに軸索の伸長を確認はしているものの、比較のためのアルゴリズムを検討し、より適切なアルゴリズムを作成している段階である。アルゴリズムが確定したら必要な数の実験を行い、両群の差について比較検討を進めていくこととする。
Strategy for Future Research Activity	現在は３Dプリンターを用いてPLAのプロトタイプチャンバーを作成し、その安全性を確認している段階である。今回テーマにしている区域培養は軸索の伸長という具体的な指標が得られるため、素材の安全性の評価にも向いていると考えているが、区域培養自体が高い技術と熟練を要求されるものであるためか、過去に同様の手法でin vitroの安全性を確認した例がない。そのため、軸索の伸長を定量的に比較するためのアルゴリズムの作成から行わなければならない。実際に培養してみると、境界から複数本の軸索が枝分かれしながら伸長していくが、それを定量的評価をどのようにするのか、チャンバーに投入する神経細胞の数や培地の量、培養開始から何日目に評価をするのかなどについて最適なところを模索していく必要があり、現在はその調整を行っている段階である。その調整が完了すれば、実験数を増やし、比較検討を行っていくことになる。比較検討が完了すれば、その後は最適なチャンバーの作成を行うことになる。一般的には細胞体の培養幅を狭くし、別区域に軸索が移動しやすい形を作っていくことになる。コの字型や円形のチャンバーなどが適切と思われるが、３Dプリンターでチャンバーを作った例はなく、今まで区域培養に用いられたチャンバーの種類は非常に限定的であるため、未知のトラブルが生じる可能性もあり、その時も検討を行う必要があると考えている。その実験を経て十分量の軸索を回収できる体制が整ったら、予定通りのガスクロマトグラフィーに移ることができるようになる。
Causes of Carryover	研究計画にある後根神経節から取得した神経細胞の培養調整に時間を要しているため。当面の目的として、区域培養を行い、神経細胞の伸長度合いを確認することとなる。そのため、培養のための物品、分離のための物品、観察のための物品、消耗品の補充が必要となってくる。培養のための物品は当然ながら神経細胞の観察を続けるうえで基本となる物品である。具体的な内容としては、素材となるマウス、DPBS、DMEM、Neuro Basalなどの培養液を始めとして、B27サプリメントや抗生剤などの添加物やNGF、GDNF、Ara-Cなどの添加酵素が必要となる。分離のための物品は、今回は単離した細胞の伸長を見るが必要があるため、摘出した組織を単一の細胞に分離していくために必要となってくる。具体的にはコラゲナーゼやディスパーゼ、トリプシンやその拮抗薬、DNAseやアルブミン、percollなどの薬剤が必要となる。観察のための物品としては、細胞の観察のために免疫染色も必要と考えられるために必要となる。そのため、免疫染色に必要な物品として抗体やブロッキングバッファーなどを購入する必要がある。さらに、上記実験に関連して当然ながらピペットやファルコンチューブ、培養用のシャーレ、解剖セット、マイクロチップやパスツールピペットなど、一般的な培養実験に必要となる消耗品なども適宜補充していく必要がある。