敗血症における原因菌の迅速同定技術の開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09402
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 川井 廉之 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (90445073)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中山 章文 岐阜医療科学大学, 保健科学部, 教授 (70536721)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 敗血症 / 迅速診断 / 16SrRNA / PCR

Outline of Annual Research Achievements

目的：敗血症患者の血液サンプルから迅速に原因菌を同定するために、培養による増菌の過程を経ずに、直接血液サンプルから原因菌の遺伝子を増幅する手法の確立を行うこと。
敗血症症例の血液サンプルから遺伝子解析法による細菌同定を行う際の課題は、サンプル中に存在する大量のヒトDNAとの非特異的反応の克服であった。このため、すでに実用化されている細菌の迅速検査法では、検査実施前にサンプルの細菌培養を行う時間を必要とし、さらに、培養困難な菌種には適応できない問題があった。この問題に対して本研究ではまず、敗血症の重要菌種の16SrRNAをターゲットにデザインされたユニバーサルプライマーのペアからヒトDNAとの非特異的反応を最も回避できるものを選出した。この方法でデザインされた一部のプライマーペアは、ヒトDNAとの非特異的反応を回避し血中に存在するごく少数の細菌の同定が可能であることが確認できた。次いで、ヒトDNAと細菌DNAの混合検体を複数作成し細菌DNAの同定の検証を行ったところ高率に細菌のDNAの増幅と同定ができることが確認された。しかし一部の菌種の同定ができなかったことからさらに検証を進める必要がある。次に、細菌が含まれていない検体における偽陽性が起こる条件の確認を行っている。市販のポリメラーゼの多くは大腸菌を用いて作成されているため、大腸菌由来の微量なDNAが偽陽性の原因となる。このため、複数のポリメラーゼの候補に対してPCR条件のチューニングを行い、偽陽性の回避ができる条件の検証を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ヒトDNAとの非特異的反応を抑制しながら細菌DNAの増幅が可能であることが確認できた。しかし、新しくデザインしたプライマーであるため、増幅可能な細菌の菌種の確認が必要である。また検出可能の限界も菌種ごとに確認する必要がある。

Strategy for Future Research Activity

複数の菌種のモデルを作成し、各菌種における検出限界と、偽陽性を確保できるPCR条件の確立を進める。一定の条件の確立の後、敗血症の臨床サンプル検体を対象とした検証を行う予定である。

Causes of Carryover

PCR条件の検証を行うために当初の想定より初年度の実験回数が増加した。これに対して翌年度の予算を前倒し支払い請求し実験を進めた。翌年に行う実験を先行して行ったため次年度の予算には大きな影響はない見込みである。