てんかん原生獲得におけるNeurovascular unit機能破綻の機序解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09484
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 馬場 史郎 長崎大学, 病院(医学系), 助教 (30530430)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 諸藤 陽一 長崎大学, 病院(医学系), 助教 (40437869)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: Neurovuscular unit / Blood brain barrier / てんかん原生獲得

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではin vitroでてんかん原生獲得におけるNeurovascular unitの破綻の機序解明および抗てんかん薬や他薬剤によるNeurovascular unit保護効果の検証を目的としている。前年度に引き続きin vitro Neurovascular unitモデルの確立を試みた。これまで製作してきた２次元invitro Blood Brain Barrierモデル（Nakagawa S: Neurochemistry International. 2009, Morofuji Y: Cel Mol Neurobiol.2010）を応用し、ニューロンを共培養することでBBB/Neurovascular unitモデルを作成する。(a)初代培養脳毛細血管内皮細胞：２－３週齢ラット（マウス）単離培養する。Puromycinを用いることにより内皮細胞の純度をほぼ100％にすることに成功した。(b)初代培養ペリサイト：同様に２-３週齢ラットより単離培養した。ペリサイトは内皮細胞を単離する操作の過程で単離。(c)初代培養アストロサイト：１－２日齢ラットよりshaking methodで単離培養した。(d)初代培養ミクログリア：１－２日齢ラットよりglial cell cultureとして培養したのちに単離培養すた。(e)初代培養ニューロン：胎生E18ラットより大脳皮質を採取し、細胞を分離させ単離培養する。単離細胞を(f)Neurovascular unit
モデル：多孔質（0.4μm, 3.0μm pore size）の半透膜をもつ立体培養皿（Transwell）を用い共培養モデルを作成を試みているが、初代培養ニューロンの成長が難しく、共培養モデルとして確立できていない。また既製の初代培養神経細胞を用いて同様の手法で共培養モデルの作成を行なっているが、確立に至っていない。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

胎生E18ラットの大脳皮質をより採取した神経細胞を分離させ、既存の多孔質（0.4μm, 3.0μm pore size）の半透膜をもつ立体培養皿（Transwell）の２次元in vitro Blood Brain Barrierモデルを用いて他の単離した脳毛細血管内皮細胞、ペリサイト、アストロサイト、ミクログリアと共培養モデルを作成を試みているが、初代培養ニューロンの成長が難しく、共培養モデルとして確立できていない。また既製の初代培養神経細胞を用いて同様の手法で共培養モデルの作成を行なっているが、確立に至っていない。

Strategy for Future Research Activity

引き続き初代培養ニューロンの採取法や試薬などを調整しながら最適な条件での脳毛細血管内皮細胞、ペリサイト、アストロサイト、ミクログリアと共培養モデルを作成を継続していく。また既製の初代培養神経細胞を用いて同様の手法を用いて共培養モデルの作成も確立できていない。Neurovascular unitモデルが確立次第、グルタミン酸や選択的AMPA型グルタミン酸受容体拮抗薬（Preampanel; PER）など薬剤を用いてけいれん発作におけるBBB/Neurovascular unitの機能破綻のメカニズム解明を試みる。Neurovascular unitモデルが確立できなかった場合、２次元in vitro Blood Brain Barrierモデルでグルタミン酸投与かでのBBB(脳毛細血管内皮細胞、ペリサイト、アストロサイト、ミクログリア)の破綻の機序を解明していく。

Causes of Carryover

すでに所有している試薬や実験資材を使用し、in vitro Neurovascular unitモデルの作成を試みたが、確立し量産することが困難であったため、当初予定していたNeurovascular unitモデルへの薬剤投与後のEVOM抵抗計(Volt-Ohm resistance meter)を用いて経内皮電気抵抗(Transendothelial electricalresistance;TEER)値測定および透過性試験でのBBB機能評価や細胞の免疫染色による形態変化の実験を実施できず、培養用の立体培養皿（Transwell）や試薬等の購入を見送った。実施予定であったこれらの研究を次年度に実施するために試薬や実験資材を購入予定である。