2023 Fiscal Year Research-status Report
てんかん原生獲得におけるNeurovascular unit機能破綻の機序解明
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19K09484
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
馬場 史郎 長崎大学, 病院(医学系), 講師 (30530430)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
諸藤 陽一 長崎大学, 病院(医学系), 准教授 (40437869)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | Neurovascular unit / Blood brain barrier / てんかん原生獲得 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、in vitroでてんかん原生獲得におけるNeurovascular unit(NVU)の破綻の機序解明および抗てんかん薬や他薬剤によるNVU保護効果の検証を目的としている。前年度に引き続きin vitro NVUモデルの確立を試みた。2次元invitro Blood Brain Barrier(BBB)モデル (Nakagawa S:Neurochemistry International.2009, Morofuji Y:Cel Mol Neurobiol.2010)を応用し、ニューロンを共培養することでNVUモデルを作成する。(a)初代培養脳毛細血管内皮細胞:2-3週齢ラット(マウス)単離培養した。Puromycinを用いることにより内皮細胞を単離。(b)初代培養ペリサイト:同様に2-3週齢ラットより単離培養した。ペリサイトは内皮細胞を単離する操作の過程で単離。(c)初代培養アストロサイト:1-2日齢ラットよりshaking methodで単離培養した。(d)初代培養ミクログリア:1-2日齢ラットよりglial cell cultureとして培養したのちに単離培養した。(e)初代培養ニューロン:胎生E18ラットより大脳皮質を採取し、細胞を分離させ単離培養し、ニューロンを(f)Neurovascular unit モデル:多孔質(0.4μm, 3.0μm pore size)の半透膜をもつ立体培養皿(Transwell)を用い共培養モデルを作成を試みているが、初代培養ニューロンの成長 が難しく共培養モデルとして確立はできていない。しかし、既製のラット脳皮質ニューロンを培養し、それをinvitro BBBモデルに共培養することが可能となった。このNVUモデルにグルタミン酸投や抗てんかん薬の投与し、継時的に経内皮電気抵抗値測定、透過性試験を行い機能評価を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
既存の多孔質(0.4μm, 3.0μm pore size)の半透膜をもつ立体培養皿(Transwell)に脳毛細血管内皮細胞、ペリサイト、アストロサイト、ミクログリアを共培養させた2次元in vitro Blood Brain Barrierモデルに初代培養ニューロンを培養したのちに共培養を試みたが、初代培養ニューロンの成長が難しく共培養モデルを確立できていなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
既製のラット脳皮質ニューロンを培養し、脳毛細血管内皮細胞、ペリサイト、アストロサイト、ミクログリアと共培養モデルの作成が可能となった。このNeurovascular unitモデルを用いて、グルタミン酸や選択的AMPA型グルタミン酸受容体拮抗薬(Preampanel; PER, Lacosamide; LCM, Levetiracetam;LEV))など薬剤を用いてけいれん発作におけるBBB/Neurovascular unitの機能破綻の メカニズム解明を試みる。
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| Causes of Carryover |
すでに所有している試薬や実験資材を使用し、in vitro Neurovascular unitモデルの作成を試みたが、確立し量産することが困難であったため、当初予定して いたNeurovascular unitモデルへの薬剤投与後のEVOM抵抗計(Volt-Ohm resistance meter)を用いて経内皮電気抵抗(Transendothelial electrical resistance;TEER)値測定および透過性試験でのBBB機能評価や細胞の免疫染色による形態変化の実験を実施できず、培養用の立体培養皿(Transwell)や試薬等の 購入を見送った。実施予定であったこれらの研究を次年度に実施するために試薬や実験資材を購入予定である。
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