2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K09491
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
吉野 篤緒 日本大学, 医学部, 教授 (50256848)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
角 光一郎 日本大学, 医学部, 助教 (20838479)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 抗腫瘍効果 / 悪性神経膠腫 / 抗てんかん薬 / 細胞周期 / アポトーシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗てんかん薬は、evidenceに基づいた投与を行えば、僅かかもしれないが悪性神経膠腫の延命効果に繋がるのではないか考えている。しかし、臨床に対する基礎的研究がほとんどない。そこで、悪性神経膠腫細胞株（等）を用いて、各種抗てんかん薬の抗腫瘍効果（細胞増殖抑制効果、遊走能や浸潤能を含む）や作用機序を検討（再開発医薬品としても期待）するとともに、化学療法施行時などにおける最善の投与方法を模索し、治療成績の向上に結び付けるための以下の基礎的実験を行ってきた。
１）各種抗てんかん薬の抗腫瘍効果
悪性神経膠腫に対する標準的化学療法薬であるTMZと抗てんかん薬であるVPAやLEVの相乗的な抗腫瘍効果を示唆する報告がある。そこで、悪性神経膠腫細胞株（６種）を用いて、標準的な抗てんかん薬の抗腫瘍効果に対して検討を行ったところ、VPAにおいて濃度依存的に細胞増殖抑制効果がみられた。
２）AMPA受容体非競合的拮抗剤の抗腫瘍効果
新規抗てんかん薬にAMPA型グルタミン酸受容体阻害薬があるが、増殖・浸潤が抑制されることも示されている。また、AMPA受容体非競合的拮抗剤であるtalampanelをTMZと併用投与した米国での第II相臨床試験では、生存期間の延長が報告されている（Grossman SA, 2009）。このように、AMPA受容体阻害抗てんかん薬は抗腫瘍効果が期待されているが、十分に検討されてない。そこで、新規AMPA受容体阻害抗てんかん薬の悪性神経膠腫細胞株に対する抗腫瘍効果を検討し、以下の結果を得た。悪性神経膠腫細胞の濃度依存的な細胞増殖抑制効果を認めた。また、Western blot において細胞周期やapoptosisの関連タンパク質の増加を認めるとともに、FACSでは抗てんかん薬としての適正血中濃度での有意な細胞周期停止および濃度依存的なapoptosisの誘導が確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
悪性神経膠腫細胞株を用いて、各種抗てんかん薬の抗腫瘍効果（細胞増殖抑制効果、遊走能や浸潤能を含む）や作用機序を検討（再開発医薬品としても期待）するとともに、化学療法施行時などにおける最善の投与方法を模索し、治療成績の向上に結び付けるための以下の基礎的実験を行ってきた。
１）各種抗てんかん薬の抗腫瘍効果：悪性神経膠腫細胞株を用いて、標準的な抗てんかん薬の抗腫瘍効果に対して検討を行ったところ、VPAにおいて濃度依存的に細胞増殖抑制効果がみられた。現在、悪性神経膠腫細胞株としてはA-172、AM-38、T98G、U-87MG、U-251MG、YH-13の６種を用い、抗てんかん薬としては標準的なVPA、LEV、CBZの３剤の抗腫瘍効果を検討している。
２）AMPA受容体非競合的拮抗剤の抗腫瘍効果：新規AMPA受容体阻害抗てんかん薬であるPERの悪性神経膠腫細胞株に対する抗腫瘍効果を検討し、以下の結果を得ている。悪性神経膠腫細胞の濃度依存的な細胞増殖抑制効果を認めた。また、Western blot において細胞周期やapoptosisの関連タンパク質の増加を認めるとともに、FACSでは抗てんかん薬としての適正血中濃度での有意な細胞周期停止および濃度依存的なapoptosisの誘導が確認された。現在、A-172、AM-38、T98G、U-87MG、U-251MG、YH-13の６種の悪性神経膠腫細胞株を用いて、PER（0 - 100 uM）を投与した後の細胞増殖抑制効果を検討している。さらに、T98GとU-251MGを用いてFACSによる細胞周期分布解析およびapoptosis 誘導解析を行った。また、PER 1uM（抗てんかん薬としての適正血中濃度）投与後、細胞周期およびapoptosis誘導に関連するタンパク質についても評価を行った。
以上、概ね計画通りに研究は進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
悪性神経膠腫細胞株を用いて、各種抗てんかん薬の抗腫瘍効果とともに、化学療法施行時などにおける最善の投与方法を模索し、治療成績の向上に結び付けるため、１）各種抗てんかん薬の抗腫瘍効果、２）AMPA受容体非競合的拮抗剤の抗腫瘍効果、等の基礎的実験を行ってきた。
今後、A-172、AM-38、T98G、U-87MG、U-251MG、YH-13の６種の悪性神経膠腫細胞株を用いて、悪性神経膠腫に対する標準的化学療法薬であるTMZと、標準的な抗てんかん薬であるVPA、LEV、CBZならびに新規AMPA受容体阻害抗てんかん薬であるPERの併用投与における抗腫瘍効果の比較検討を行う。更に検討を進め、その効果が相乗であるか相加であるのかChou Talalay methodを用いて検討を加える。また、作用機序の違い等の検討を行う（apoptosis、cell cycle、細胞死の検討：apoptosisだけでなくnecrosis、necroptosis、autophagyやferroptosis、等を検討する）。
一方、AMPA受容体阻害により浸潤が抑制されることも示されている（Ishiuchi S, 2002）。そこで、抗てんかん薬の悪性神経膠腫に対する浸潤能や遊走能に対しても検討を行う（migration および invasion assay：migration assayとして、scratch assayおよびtranswell assayを行う。また、invasion assayではinvasion chamberを用いる）。
また、膠芽腫の治療はglioma stem-like cells (GSCs)を対象、あるいは幹細胞の側面を理解とした戦略に転換する必要もあると考えられる。そこで、GSCsに対する標準的な抗てんかん薬の抗腫瘍効果の検討も行いたい。
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| Causes of Carryover |
物品費である消耗品費、特に抗体、Western blottingに掛かる費用、あるいは悪性神経膠腫細胞株の培養に関わるフラスコ、培養液、 チップ類、ピペット類など、当教室にて購買してあったものを使用した。そのために、消耗品等物品費の支出が少なく研究を遂行することができた。 細胞株培養関連消耗品、細胞培養栄養因子、各種免疫染色用抗体、免疫染色用２次抗体、免疫染色用試薬、チップ類、ピペット類、RNA抽出キット、DNA抽出キットなど、それぞれ10万円の予算を組んだが、上記のごとく既存のものを使用したために少額の支出となった 。 結果として、次年度使用額が 976,200円となった。
次年度には、消耗品等の物品費は相当額掛かるものと考えている。当該年度は、当教室にて購買してあった既存のものを使用したために、支出が少なく研究を遂行することができた。しかし、既存の消耗品はほぼ使用している。特に、申請時には次年度の消耗品費として、各種免疫染色用抗体、免疫染色用２次抗体、免疫染色用試薬等は計上していない。まずは、次年度使用額はこれらの消耗品費にあてたい。また、不足分が発生した場合は、次年度の人件費・謝金、その他の計上費用を当てることを考えている。次年度使用額は、976,200円であるが、上述の通り、物品費である消耗品費に当てる予定である。
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