炎症性ケモカインCCL2阻害薬によるグリオーマ腫瘍幹細胞休止期駆逐療法の基礎研究

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09497
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 浅野 研一郎 弘前大学, 医学研究科, 准教授 (90312496)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 悪性グリオーマ / Fbxw7 / 炎症性ケモカイン / CCL2阻害剤 / 腫瘍幹細胞休止期駆逐療法

Outline of Annual Research Achievements

初年度はIn vitro 腫瘍幹細胞休止期駆逐療法の確立を目指すこととした。腫瘍細胞の浸潤した人工基質へのプラスミンを基質の融解媒体として投与後、CCL2阻害剤を投与する。簡易フローサイトメータを用い腫瘍細胞が細胞休止期から駆逐されていることをG1レベルで確認した。病理標本ではCD133やnestinの検索を行い発現低下が確認されたが、一部IL2やIL6の発現が強く見られ、一部炎症は反応が強くなることが示唆されVEGF発現も強くなる傾向がみられた。この炎症反応をいかに弱く抑えるかという課題が提起された。
本年度はそのためIn-vivoの実験にてC6グリオーマ細胞をラット脳内に移植後、摘出を行わず、CCL2阻害剤の直接注入をおこなった。14日後移植脳腫瘍の摘出を行った。まず炎症反応の解明を行い、VEGFの発現のみならず腫瘍微小環境について調べ、炎症性リンパ球の浸潤も強いことがわかった。そのためそのラット移植腫瘍の摘出を用い、抗VEBF剤の投与と抗PD-1抗体薬、抗PD-L1抗体薬の3者を比較した。その結果抗VEGF剤の投与が無難との結果がえられた。
その後実際の腫瘍モデル、手術モデル、治療モデルを作成した。さらに病理標本を作製し腫瘍細胞の駆逐状態と炎症反応の惹起と脳浮腫を確認した。その後抗VEGF抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体を投与し、抗VEGF抗体の効果が良いことが分かったが、腫瘍幹細胞の根治には至っていないことが確認された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度は昨年度課題として露呈した炎症反応本体の解明をまず行うこととした。VEGFのみならず炎症性免疫細胞の発現も見られたため、腫瘍微小環境の解明を行うべくIn vivoのラット脳腫瘍移植モデルを作成しCCL2阻害剤投与後、摘出後病理標本検討を行った。昨年度課題として露呈したIL2、IL6、VEGFの発現のみならず、炎症性免疫細胞の出現が目立った。特に腫瘍微小環境としてのPD-1、PD-L1、PD-L2陽性のCD-8陽性T-cell の発現が強く見られた。そのため、in-vivoの実験として抗VEGF薬、抗PD-1抗体薬、抗PD-L1抗体薬の効果比較を行い、抗VEGF薬が0.6mM/molで経済的にも効果的に炎症を抑えることを確かめた。
その後実際腫瘍モデルを作成し、手術、プラスミン処置を行いCCL2阻害剤を注入した治療モデルを作成し、ほぼ一定のモデル作成が完成した。しかし病理標本を検討すると、ごくわずかにCD133、nestin陽性の腫瘍細胞が見られることを確認し、未だ根絶に至っていないことが分かった。現在その原因の解析中である。

Strategy for Future Research Activity

研究は全体的に遅れ気味である。
これは前記の如く、未だCD133、nestin陽性細胞が混在しており、この原因を検索中である。病理組織により解析は現在集計中であるが、まだフローサイトメトリーによる細胞解析が未完了である。そのため解析を進め腫瘍幹細胞を限りなく少なくする方策の検討が残されている。また技術的問題として病理学的検索ではCCL2阻害剤が均一に分布していない可能性も示唆された。つまり腫瘍摘出後のCCL2阻害剤が血腫や肉芽組織により影響を受けている可能性も示唆されている。
そのためより詳細な病理学的検討と腫瘍微小環境の解明が必要で実験モデルの多少の改良の余地がある。その後はin vivoの実験系の安定的に稼働できることを確認後、治療効果の確認と生存試験を行う方策である。