悪性髄膜腫における細胞内エネルギー代謝障害の解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09501
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 工藤 琢巳 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 非常勤講師 (90632125)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 悪性髄膜種 / 糖代謝

Outline of Annual Research Achievements

本研究目的は、分子細胞生物学的手法を用いて、悪性髄膜腫の発生、発育機序を明らかにし、新たな治療標的を同定すること、及び悪性髄膜腫の動物モデルを作成することである。先行研究により良性髄膜腫と悪性髄膜腫の摘出標本における全遺伝子の発現状況を解析した結果、もっとも悪性髄膜腫に影響を与える遺伝子として解糖系酵素であるPGK1(Phosphoglycerate Kinase 1)が同定された。PGK1は多くの悪性腫瘍においてその発現が亢進し、また強力な予後不良因子である。またPGK1の発現抑制した悪性髄膜腫細胞は細胞増殖が抑制された。さらに遺伝子発現状況をもとにしたfunctional analysisではミトコンドリアの機能障害が示された。以上の結果から、PGK1の過活動およびミトコンドリアの機能障害による解糖系への代謝シフトが悪性髄膜腫の発生に関与している可能性が示唆される。
一昨年の研究から、PGK1発現抑制が細胞増殖をが鈍化し、colony formationも弱めた。一方でGateway technologyを用いたPGK1の過剰発現はcolony formationを強めた。また現在低酸素状況下ではより一層PGK1の発現により細胞の表現型に変化が得られている。CRISPR-Cas9 systemにより恒常的なPGK1の発現抑制株作成を行ったが、発現が抑制された細胞株はcell deathを引き起こした。
エネルギー代謝解析目的で、低酸素状況およびPGK1の発現抑制細胞株を用いて、メタボローム解析を行った。解糖系においてPGK1より下流ではPGK1発現抑制株で明らかに代謝産物が減少していたが、TCA cycleではその差は消失していた。このことはPGK1発現量変化がもたらす表現型の変化がかならずしもATP産生量に依存するものとは言えないことを示している。また動物実験の条件検討を行っているところである。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

上述の通り、PGK1発現抑制は細胞増殖が鈍化しまたcolony formationも弱まった。一方でGateway technology を用いた過剰発現はcolony formationを強めた。低酸素状況下ではより一層PGK1の発現により細胞の表現型に変化が得られている。さらにメタボローム解析ではPGK1発現抑制によりPGK1下流において優位に糖代謝産物が減少していた。PGK1発現量変化による表現型の変化は、当初は糖代謝状況変化に伴うエネルギー産生能量の変化に依存しているものと考えていた。しかしTCA回路内での代謝産物はかならずしもPGK1発現量に依存しているものではなかった。これは他のエネルギー代謝経路からの影響が考えられる。またエネルギー代謝以外でのPGK1による影響の可能性も示唆された。
CRISPR-dCas9を用いた発現抑制細胞株を作成したが、一時的に発現抑制ができたもののすべての細胞が死滅した。解糖系酵素であり完全な発現抑制は致死的であることが予想される。現在はsiRNAを用いた一過性の発現抑制系を用いて代用している。
現在動物実験の条件検討を行っているところであるが、細胞株は恒常的な過剰発現株を用いて行うこととする。

Strategy for Future Research Activity

上述の通り恒常的発現抑制株作製は困難であり、siRNA法を用いた一過性の発現抑制によって代用する。もともと動物実験では過剰発 現細胞株を用いた薬剤投与実験を主として計画しており、実験計画としては概ね順調に進展していると考えているが動物実験の条件検討に難渋している。またPGK1による解糖系エネルギー代謝変化を主としたものではなく、他のエネルギー代謝変化やそもそも糖代謝とは無関係なoncogenesisの可能性があり、その探索を行う必要がある。PGK1はDNA polymerase alfa のコファクター蛋白として報告されており、これによる細胞表現型変化の可能性を模索する。

Causes of Carryover

上述の通り実験内容を変更する必要があった。また昨今の世界的な情勢により十分に研究しで研究を行うことができなくなっている。そのため予定より物品を購入することができず次年度に繰り越すこととした