2020 Fiscal Year Research-status Report
Identification of endothelial cell origin microRNA as a clinical marker and therapeutic target of EBI after SAH
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19K09516
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
高橋 里史 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (20383870)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
荒井 信彦 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (80793801) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | くも膜下出血 / 早期脳損傷 / マイクロRNA / 虚血性脳障害 / 脳血管攣縮 / 脳血管内皮細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
くも膜下出血モデルマウス（脳圧を測定することで均一化した前方循環血液注入モデル）とシャム手術を行ったコントロールマウスそれぞれから、モデル作成後72時間後にマウスをsacrifyし、大脳皮質脳毛細血管由来の内皮細胞を単離することに成功した。計画していたモデルマウスは安定して作成できるようになり、当初難渋した大脳皮質毛細血管内皮細胞の単離も安定して行えるようになった。
単離したそれぞれの内皮細胞から遺伝子を抽出しマイクロアレイ解析を行った。マイクロアレイ解析の結果、くも膜下出血群とコントロール群由来の内皮細胞内で発現が2倍以上差がある12種類のマイクロRNAと86種類の遺伝子を同定した。86種類の遺伝子の中から、発現プロファイルと既知の遺伝子機能をもとに4つの遺伝子を選別し、それぞれに関してタンパクレベルでの発現解析および機能解析を開始した。
また同じモデルを用いて、やはりモデル作成後72時間後に採取した血液から血清を分離し、遺伝子を抽出、マイクロアレイ解析を行い42種類のくも膜下出血群とコントロール群で発現が2倍以上差があるマイクロRNAを同定した。自験の先行研究で行ったくも膜下出血患者血清中のマイクロRNA発現プロファイルと今回の結果を照合し、提供を受けた患者検体は、くも膜下出血以外の病態も反映している可能性が高いため、モデルマウスの血清中において同定したマイクロRNAのオルソログを先行研究の結果得られたくも膜下出血患者で発現プロファイルが変化するマイクロRNAの一群と照合することで、両者で共通して同定された4種類の共通するマイクロRNAを確認した。これら4種類のマイクロRNA関して標的遺伝子を含め解析を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2020年度はCOVID-19のパンデミックにより一時研究室への立ち入りが禁止された。動いていた研究を一度全て停止しなければならず、研究停止前の状態に戻るまでに半年以上を要した。このため、研究計画にやや遅れが生じたが、再開後にペースをあげ、遅れを取り戻しつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究で大脳皮質毛細血管内皮細胞においてくも膜下出血の影響により発現に変化を認めた一群の遺伝子のうち、in silicoでのスクリーニングを加え選別した4種類の遺伝子に関して、タンパクレベルでの発現をWestern blot、組織染色、細胞染色で確認する。またsiRNA、及び遺伝子導入を行い当該遺伝子の発現を修飾したうえでBBBの結合能や細胞の移動能、viabilityを評価し、当該遺伝子が血管内皮細胞に、ひいてはくも膜下出血後の虚血性脳障害に与える影響を検証する。
今回の研究成果で得られたくも膜下出血モデルマウス血清中のマイクロRNA発現プロファイルのデータと先行研究の患者検体を用いたくも膜下出血患者におけるマイクロRNA発現プロファイルの変化の検討から同定した4種のマイクロRNAに関して虚血性脳障害への関与を検証し、治療標的及び血液中バイオマーカーとしての有用性を検証する。
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| Causes of Carryover |
2020年度はCOVID-19のパンデミックにより一時研究室への立ち入りが禁止された。動いていた研究を一度全て停止しなければならず、研究停止前の状態に戻るまでに半年以上を要した。このため、研究計画に遅れが生じ、結果として次年度使用分の予算が生じた。しかし、研究再開後に研究成果が出始め、目的とするくも膜下出血による影響を受けた脳血管内皮細胞由来の遺伝子とくも膜下出血の影響を受けて発現プロファイルが変化する血液中で同定可能なマイクロRNAのスクリーニングを終えることが出来た。このまま予定通り研究を継続し、残された期間と予算で当初の予定を完了すべく、残された遺伝子およびマイクロRNAの発現及び機能解析を遂行していく予定である。
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