Macrophage in glioblastoma activates receptor tyrosine kinase

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09529
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 貞廣 浩和 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (50509320)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 膠芽腫 / 腫瘍関連マクロファージ

Outline of Annual Research Achievements

山口大学医学部附属病院で手術を行う膠芽腫標本を摘出直後に採取し、蛋白分解酵素を用いてsingle cell suspensionを行って、lympholyteを用いて赤血球を除去した。抗体を用い、膠芽腫よりマクロファージのみsortingして、48時間選択培養を行い、遠心分離してcondition mediumを採取した。山口大学医学部附属病院で樹立したヒト膠芽腫幹細胞株やcommercialされているヒト膠芽腫細胞株を24時間飢餓状態にした後、そのcondition mediumにさらし、網羅的なphospho-proteomicsを行うことによってどのRTKが強くリン酸化されているかを確認した。
山口大学医学部附属病院で手術を行った膠芽腫の病理標本を用い、TAMが膠芽腫のどのような病理像の部分に多く存在するか、CD11bの免疫染色を行った。この際、病理像を①腫瘍境界領域、②細胞集族領域、③壊死領域、④血管増勢領域に分類し検討した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

腫瘍からのマクロファージ採取はうまくできたが、飢餓状態にした細胞にmediumをさらし、RTKのリン酸化を確認したかったがこの結果がうまく得られず、再実験の必要がある。

Strategy for Future Research Activity

RTKのリン酸化の確認方法を再検討し、リン酸化されるtarget RTKをピックアップする。SCID mouseにヒト脳腫瘍幹細胞株を移植し、脳腫瘍モデルを作成して、モデルより脳腫瘍を摘出し、CD11b抗体でTAMをsortingし選択培養する。そのcondition mediumによって膠芽腫細胞のTarget RTKがリン酸化されるかどうかをWestern blottingで検証する。リン酸化が確認されれば、そのligandを選別しTAM培養を行ったcondition mediumに含まれているかどうかELISAで検証する。

Causes of Carryover

経費がうまく抑えられたため。次年度に培養などの物品費として使う。