2019 Fiscal Year Research-status Report
新規ウイルス投与法によるALS局所モデルと治療法の探索:TDP43断片化の病理
Project/Area Number |
19K09532
|
Research Institution | University of the Ryukyus |
Principal Investigator |
神里 興太 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10554454)
|
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
垣花 学 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20274897)
|
Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
Keywords | 筋萎縮性側索硬化症ラットモデル / 軟膜下投与 |
Outline of Annual Research Achievements |
本年度、1).断片化tranactive response DNA binding protein of 43kDa(TDP-43)を神経細胞においての誘導するためのウイルスベクターの作成、2)ラット軟膜下投与によるTDP-43断片化C末端遺伝子導入と電気生理学的評価、という2つの計画に関し以下の検討を行なった。 1)「TDP-43断片化C末端遺伝子を神経細胞においての誘導するためのウイルスベクターの作成」のためにsynaptophysinをプロモーターとしてアデノ関連ウイルスセロタイプ9を作成した(AAV9-syn-pTDP43)。ヒト神経芽細胞腫培養細胞を用いた遺伝子発現実験およびタンパク発現実験のためにユビキチンをプロモーターとしたウイルス(AAV9-UBI-pTDP43)を作成し、その発現を検討した。pTDP43-mRNAが上昇していることを確認できた。一方、ウェスタンブロッティングによるタンパク発現を確認した。 今後、ラット初代神経培養細胞におけるAAV9-Syn-pTDP43による遺伝子導入効率に関して確認する予定である。 2)「ラット軟膜下投与によるTDP-43断片化C末端遺伝子導入と電気生理学的評価」のために、予備実験として緑色蛍光たんぱく(GFP)を誘導する実験を実施した。そのためのコントロールウイルスとしてアデノ関連ウイルスセロタイプ9を作成した(AAV9-Syn-GFP)。作成したAAV9を野生型SD系ラット脊髄に軟膜下投与した。投与後6-8週後における免疫組織学的検討でGFPの強力な発現を確認できた。 今後は、作成したAAV9-Syn-pTDP43を軟膜下に投与し、タンパク発現と神経細胞死の組織学的評価、さらに電子生理学的評価を行う計画である。
|
Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
AAV9(AAV9-UBI-pTDP43 / AAV9-Syn-pTDP43 / AAV9-Syn-GFP)の作成とその評価に関しては問題なく実施できている。また、手術としてラット軟膜下ウイルス投与に関しても手技的な問題は生じておらず、このまま検討を継続して問題はない。 1)「TDP-43断片化C末端遺伝子を神経細胞においての誘導するためのウイルスベクターの作成」のためにAAV9-UBI-pTDP43およびAAV9-syn-pTDP43を作成した。ヒト神経芽細胞腫培養細胞を用いた検討でpTDP43の発現を検討した。今後、ラット初代神経培養細胞におけるAAV9-Syn-pTDP43による神経に対する遺伝子導入効率に関して確認する予定である。 2)「ラット軟膜下投与によるTDP-43断片化C末端遺伝子導入と電気生理学的評価」のために、予備実験として緑色蛍光たんぱく(GFP)を誘導する実験を実施した。そのためのコントロールウイルスとしてアデノ関連ウイルスセロタイプ9を作成した(AAV9-Syn-GFP)。作成したAAV9を野生型SD系ラット脊髄に軟膜下投与した。投与後6-8週後における免疫組織学的検討でGFPの強力な発現を確認できた。今後は、作成したAAV9-Syn-pTDP43を軟膜下に投与し、タンパク発現と神経細胞死の組織学的評価、さらに電子生理学的評価を行う計画である。これまでのG93Aマウス等トランスジェニック動物における検討から120-150日の観察が必要であると考えられる。また、電気生理学的検討を実施していくための予備実験を早期開始する予定である。その予備実験として、筋攣縮を生じるラットモデルとして高位胸髄横切断モデルを使用する予定である。このモデルに関しては研究代表者に作成実績があり、技術的問題はない。
|
Strategy for Future Research Activity |
当初の計画通りに研究を推進する予定である。 ウイルス作成に関して、その感染効率に関しての検討を初代神経培養系において検討する。初代神経細胞採取・培養技術は当施設において確立しており問題はない。 動物モデルにおける検討に関して、今後は作成したAAV9-Syn-pTDP43を軟膜下に投与し、タンパク発現と神経細胞死の組織学的評価、さらに電子生理学的評価を行う計画である。電気生理学的検討を実施していくための予備実験を早期開始する予定である。その予備実験として、筋攣縮を生じるラットモデルとして高位胸髄横切断モデルを使用する予定である。このモデルに関しては研究代表者に作成実績があり、技術的問題はない。
|