コンディショナルノックアウトラットを用いたMkxの発生・恒常性維持機構の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09544
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 伊藤 義晃 東京医科歯科大学, 統合研究機構, 助教 (50511044)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: Mkx / 腱

Outline of Annual Research Achievements

腱は、骨と筋肉を繋ぎ、運動機能の要となる結合組織で、外傷や疾病、加齢による腱の損傷はQOLの低下を招く。腱は栄養血管が少ないことから再生能力に乏しく、腱損傷に対する新たな治療法の開発が望まれる。しかしながら、その基盤となる形成・維持機構は未だ不明な点が多く、その解明が急務となっている。申請者らは、腱・靭帯で特異的に発現する転写因子であるMkxが、腱形成・恒常性維持に重要な遺伝子であることを、ノックアウト (KO)マウスおよびより大型で運動器の研究に有用なKOラットの解析により明らかにした。本研究では、腱疾患の病因解明や治療法確立の基盤となる腱の形成・維持機構を解明することを目的に、腱の形成・恒常性維持におけるMkxの機能についてコンディショナルKOラットを用いた解析を行う。当初はMkx-floxラットおよびMkx遺伝子座にCreER-T2遺伝子をノックインしたMkx-CreERラットを掛け合わせてコンディショナルKOラットを作製・解析することを計画していたが、Mkx-CreERラット作製が困難であったため、Cre遺伝子を発現するウイルスベクターを用いて導入する手法を試みた。まずはラットの尾腱およびアキレス腱から腱細胞を取得する方法について検討し、Mkx-floxラット腱細胞を取得することに成功した。4週齢のMkx-Floxラットのアキレス腱から細胞を採取し、Cre遺伝子を導入してqPCRによる発現解析を行ったところ、Mkxの発現が抑制され、さらに腱・靭帯の主成分であるCol1a1などの腱・靭帯関連遺伝子の発現減少を確認した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

コンディショナルKOラット作製に必要なMkx-CreERラットの作製を何度も実施したものの、結果的には目的のラット取得に至らなかったため、進捗状況はやや遅延している。Mkx-CreERラット作製を継続しつつ、ウイルスベクターによるCre導入による細胞実験を優先して進めている。

Strategy for Future Research Activity

MkxコンディショナルKOラットの解析においては、Mkx-CreERラット作製を引き続き継続しつつ、腱細胞を用いた実験を優先して進めていく。コンディショナルKO細胞を用いて、腱・靭帯の形成・維持に関連する遺伝子の発現解析、RNA-seq、Flag-Mkx遺伝子を導入したChIP解析による標的遺伝子の同定などを行っていく。さらにメカニカルストレスの影響の調査について明らかにするために、メカニカルストレスを付加したin vitroでの培養系についても視野に入れ実施していく。以上の研究を遂行してMkxの腱形成・維持における分子メカニズムについて解析する。

Causes of Carryover

Mkx-CreERラットが取得出来なかったため、ラット関連の費用が減少したため。本経費は、次年度のMkx-CreERラット作製実施と細胞を用いた実験を優先して使用していく。