間葉系幹細胞シートを用いた神経束移植における新規治療法の確立

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09559
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 田中 康仁 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (30316070)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 増田 佳亮 奈良県立医科大学, 医学部附属病院, 研究員 (60790376) ; 清水 隆昌 奈良県立医科大学, 医学部, 学内講師 (70464667) ; 奥田 哲教 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (80646167)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 間葉系幹細胞シート / 末梢神経 / 神経再生 / 血管柄付き神経 / 自家神経移植

Outline of Annual Research Achievements

骨髄間葉系細胞（Bone Marrow Stem/Stromal Cells ; BMSCs）を採取培養し、シート状に採取する『BMSCシート』は再生医療分野において有用である。『BMSCシート』は、細胞単独の移植に比べて、細胞外基質、接着因子を有し生着率において優れている。また『血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growthfactor; VEGF）』など様々な成長因子を有し、虚血皮弁モデルにおける『血管新生』促進効果や、脊髄損傷モデルにおける、『軸索再生』促進効果を示す。
本研究では、自家神経の移植片に旺盛な血流を付加させるために、再生医療の技術を用いて作成した『BMSCシート』を用いる。すでに自家神経移植に『血管柄付き筋膜脂肪組織』を単独で組み合わせる試みや、間葉系幹細胞を単独で組み合わせる研究は行われている。しかし、『BMSCシート』は、細胞単独の移植と比べて生着率が高く、『血管新生能』と『神経再生能』を有する理想的なマテリアルであると考えられる。『ハイブリッド型神経束移植（tissue engineering nerve cable graft）』を作成するという、これまでに報告のない高い独自性を有する。我々の方法が、シュワン細胞の生存率を改善し、移植後の有効な軸索再生を促すことが可能であるかの検証を研究の目的とする。
自家神経移植においては、『BMSCシート』は有用性を有するが、当初予想していたシュワン細胞の生存率を改善する作用以外にも何らかの影響がある可能性が確認された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

『BMSCシート』の作製に関して、7週齢Fischer344ラットの両側大腿骨から骨髄間葉系細胞を採取しT75フラスコを用いて初期培養を行う。細胞培養は、MEMに
15%牛胎血清（FBS）と抗生剤を加えたものを標準培地として使用。2週間後に、トリプシンを用いて細胞を培養皿から遊離させ、これを1×10４cell/cm2の細胞密
度で6cm径の培養皿に播種する。アスコルビン酸（AscP；82μg/ml）添加標準培地で二次培養を行い、2週間後に『BMSCシート』を採取できた。
ラット背部皮下に以下の3群からなる自家神経を移植し、『シュワン細胞の生存率』を評価した。欠損モデルに移植を行う前に、移植片の固有のシュワン細胞の生存率を評価する。①同系ラットの坐骨神経を20mm採取し背部皮下に移植　Autologous nerve群；AN群②同系ラットの腓腹神経20mmを3本採取し背部皮下に移植　Cable graft群；CG群③②で周囲を『BMSCシート』で被覆するHybrid cable graft群；HCG群を作製した。移植後3, 7, 10, 14日目の組織形態学的評価。シュワン細胞をS-100で染色、TUNEL法による死細胞数の評価を行い、生存率を評価した。背部皮下に移植するモデルでは14日までの期間では、明らかなシュワン細胞の生存率の違いを認めなかった

Strategy for Future Research Activity

坐骨神経欠損モデルをラットで作成し、以下の５つの実験群を作製する。
Fischer344ラットの右坐骨神経に約15mmの欠損モデルを作成。欠損部を以下のモデルで再建する。①同系ラットの腓腹神経(20mm)採取し遊離自家神経移植するAutologous nerve群；AN群、②同系ラットの腓腹神経(20mm)を3本採取し神経束移植するCable graft群；CG群、③②で周囲を『BMSCシート』で被覆する Hybrid cable graft群；HCG群、④坐骨神経の20mmの欠損を、再建せずにそのまま放置するNegative control群；NC群、⑤皮膚切開のみを施し、神経に操作を加えないPositive control群；PC群。
評価として、術後3, 7, 10, 14日で、自家神経内の軸索再生の評価を免疫組織学的行う。（軸索再生；Tuj-1,GAP43抗体、神経細胞；NeuN抗体、血管新生；αSMA抗体、グリア瘢痕；GFAP,CS56抗体、再髄鞘化；MBP抗体）M2マクロファージの局在をCD206、arginase-1(Arg1)を用いて行う。　血管新生の評価はICG（Indocyanine green）を用いた近赤外線蛍光イメージング手法を用いてラットに尾静注したICGを赤外線カメラで撮像することで行う。さらに術後4, 8, 12, 16週で、前脛骨筋の筋力、筋実質量、電気生理学試験で複合筋活動電位.（compound muscle action potential；CMAP）、足関節の可動域、腓骨神経の組織形態計測を行い、神経再生を評価する。

Causes of Carryover

新型コロナウィルスのパンデミックによって、予定してた海外の学会参加などが中止になったため、差額が生じた。