2020 Fiscal Year Research-status Report

間葉系幹細胞におけるTAK1-Hippo経路の重要性の解明

Research Project

Project/Area Number	19K09562
Research Institution	Kindai University
Principal Investigator	小野寺勇太近畿大学, 大学病院, 助手 (30510911)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	寺村岳士近畿大学, 大学病院, 講師 (40460901) 竹原俊幸近畿大学, 大学病院, 助教 (60580561)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	間葉系幹細胞 / Tak1 / プロテオミクス解析 / 細胞増殖 / 抗ストレス / 細胞移植
Outline of Annual Research Achievements	現在の再生医療において間葉系幹細胞（MSC）は中心的な細胞材料の一つである。良好な臨床効果が複数報告されているものの、MSCの幹細胞性維持機構はほとんど解明されておらず、移植資源を安定的に供給する上で大きな障壁となっている。我々はこれまでの先行研究からMAP3K の1つでTgfβシグナルを伝達するTgfβ-activated kinase（Tak1）を欠くMSCは殆ど増殖出来ないという知見を得た。また研究の進展より、Tak1と細胞増殖や器官サイズの制御を担うHippo pathwayの重要因子であるYap1 / Tazとの関係が明らかとなり、Tak1阻害による静止期同期を応用した新たな移植用細胞調整法の可能性を見出した（2019, Stem cells, doi: 10.1002/stem.3083.）。初期胚や多能性幹細胞、皮膚、造血幹細胞、肝細胞、神経堤細胞、筋衛星細胞でTak1の機能の重要性が報告されている。我々の成果から、MSCまたはマウス個体でのTak1の継続した阻害効果として●分化能力への影響、●細胞周期の停止、抗ストレス遺伝子等の発現の上昇、●解糖系代謝への傾倒、●骨髄内MSCの細胞数および有意な体重減少が生じるが投与中止後は回復する（Tak1阻害は不可逆的である）といった様々なことが明らかとなった。 Tak1の更なる機能の解明を試みる為にTak1に相互作用しているタンパク質に対しプロテオーム解析（coIP-MS）を実施した。6000種類以上ものタンパク質が同定された中から、タンパク質Ｘに着目した。MSCにおいてタンパク質Ｘを抑制すると、細胞増殖は抑制され、若齢マウスと老齢マウスの骨髄由来MSCで発現量を比較すると老齢マウスで有意に発現量が低いことが明らかとなった。今後、同定されたタンパク質のさらなる機能解析を行って行く予定でいる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本申請では、「Tak1とHippo pathwayとの連関を中心にMSCの増殖制御機構に迫るとともに、Tak1阻害がもたらす静止期同期を応用した新しい移植用細胞調整法の可能性を検討する。」としていた。初年度ではあるものの、Tak1と細胞増殖や器官サイズの制御を担うYap1 / Tazが核内で相互作用することで細胞増殖を制御していること、Tak1の結合が外れるとYap1 / Tazの分解が促進されること、 Tak1の活性化を抑制したMSCが静止期特有の性質であるストレス耐性を示すことを活かした新たな移植方法の考案と、研究成果を「Stem cells」（doi: 10.1002/stem.3083.）にて発表した。 2020年度は、昨年、解決すべき課題として取り上げたTak1の結合ドメインを含む相互作用解析を実施した。MSCの核内に発現するTak1と相互作用しているタンパク質を共免疫沈降法によって回収した。抗体-マグネティックビーズにより回収してきた複合体をトリプシンによりオンビーズ消化し高深度DIAプロテオーム解析を実施した。昨年報告したYap1も含め、数千種類ものタンパク質が一度に同定され、機能などで細分化したデータ解析に多くの時間を費やした。その中から、増殖や分化に関する機能が報告されているタンパク質および、検出されたアミノ酸数などから同定の信頼度の高いタンパク質Xを抽出した。 MSCにおいてタンパク質Xの遺伝子発現をsiRNAによりノックダウンすると増殖が抑制されることを確認した。また、細胞周期解析においてもG2/M期の減少を確認した。次にMSCにおけるタンパク質Xの恒常的な発現細胞株を作製し、脂肪および骨への分化能を確認したところ、骨分化はするものの脂肪分化は著しく抑制されることが判明した。
Strategy for Future Research Activity	今後は、Tak1に結合するユニークなパートナータンパク質を同定することを目的とし、高深度DIAプロテオーム解析により検出された膨大なタンパク質の更なる解析を進める。また、増殖や分化で影響が観察されたタンパク質Xにおいても解析を進め、間葉系幹細胞の未分化維持に関わるカスケードを解明したいと考えている。また、Tak1の活性化抑制が増殖や抗ストレス機能に影響を与えたこと、タンパク質Xが老齢マウスでも発現が低下している事から、老化細胞、老齢マウスへのアンチエイジング効果への応用も考えている。老齢マウスにおけるMSCはFACS解析において不均一な細胞集団を形成する事が分かっている。体内においては加齢と共に慢性的な微炎症状態も観察されており、老齢マウスにおけるTak1抑制効果が体内の幹細胞にもたらす効果を検討したいと考えている。さらに、最終年度はマウスのみならずヒト骨髄由来MSCにおいても検討を予定しており、種を越えた普遍的な制御機構の解明にも挑戦する。 2021年度は本研究の最終年度となる事から、プロテオミクスを駆使したマウス・ヒトMSCの制御機構を解明し国内外への発表を目指していきたい。
Causes of Carryover	2年目には昨年度の予定通り時間と予算の多くを詳細な解析の実施の為に使用した。膨大なデータの解析に専念したことから、裏付けとなる細かな実験・解析を最終年度で行う予定でいる。その都合に合わせ、2年目の予算執行を極力抑える事として研究を遂行した。