2021 Fiscal Year Research-status Report
I型筋強直性ジストロフィー疾患iPS細胞を用いたリピート伸長メカニズムの解明
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19K09565
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
加門 正義 愛媛大学, 医学系研究科, 助教 (90557224)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 疾患iPS細胞 / DM1 / リピート病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
I型筋強直性ジストロフィー(DM1）はリピート病の一つで、DMPK遺伝子の3’非翻訳領域に存在するCTGリピートが異常伸長することが原因である。最近の研究で、異常伸長したリピートがスプライシング異常を引き起こすことで骨格筋をはじめとした臓器に異常が生じることが明らかになってきているが、リピート自体がなぜ伸長するのかはよく分かっていない。そこで本研究では、DM1患者由来iPS細胞を用いたリピート伸長の細胞モデルでリピートが伸長するメカニズムの解明を行った。
申請者は樹立したDM1-iPS細胞をクローニングし、遺伝背景が同一でリピート長のみ異なるクローンを得た。これらのクローンを長期継代培養後にリピート長を解析し、リピートの伸長が抑制されているクローンを発見した。さらに、リピート伸長抑制クローンとリピートが伸長するクローンの遺伝子発現をマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析により比較し、リピート伸長抑制候補遺伝子を得た。得られた候補遺伝子をDM1-iPS細胞にノックダウンまたは強制発現させることで、リピートの伸長が抑制されるかを検討したところ、ノックダウンで伸長を抑制する遺伝子と強制発現で伸長を抑制する遺伝子をそれぞれ1つずつ同定した。DM1原因遺伝子DMPKのリピート近傍のDNAメチル化状態を解析したところ、DM1-iPS細胞クローンで健常者iPS細胞に比べて増加していることが確認できたが、リピート伸長抑制クローンとリピートが伸長するクローンではほとんど違いはないことを明らかにした。また、リピート伸長抑制候補遺伝子の1つをリピート配列を安定に持たせたC2C12細胞に強制発現させることで、リピート配列に結合することを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
申請者は樹立したDM1-iPS細胞をクローニングし、遺伝背景が同一でリピート長のみ異なるクローンを得た。これらのクローンを長期継代培養後にリピート長を解析し、リピートの伸長が抑制されているクローンを発見した。さらに、リピート伸長抑制クローンとリピートが伸長するクローンの遺伝子発現をマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析により比較し、リピート伸長抑制候補遺伝子を得た。得られた候補遺伝子をDM1-iPS細胞にノックダウンまたは強制発現させることで、リピートの伸長が抑制されるかを検討したところ、ノックダウンで伸長を抑制する遺伝子と強制発現で伸長を抑制する遺伝子をそれぞれ1つずつ同定した。DM1原因遺伝子DMPKのリピート近傍のDNAメチル化状態を解析したところ、DM1-iPS細胞クローンで健常者iPS細胞に比べて増加していることが確認できたが、リピート伸長抑制クローンとリピートが伸長するクローンではほとんど違いはないことが明らかになったことから、同定した2遺伝子の機能に関する解析を中心に進めることにした。これらの遺伝子がCTGリピートに直接結合するかどうか検討を行うために大腸菌でのリコンビナントタンパク発現系の構築とin vitroでのタンパク-リピート配列結合実験系の確立を目指したが難航したため、リピート配列を安定に持たせたC2C12細胞に候補遺伝子を強制発現させてChIPアッセイを行うことで、リピート配列に結合することを確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
リピート伸長抑制遺伝子として同定した2遺伝子の機能解析を引き続き行い、リピートの伸長を抑制するメカニズムを明らかにする。候補遺伝子がタンパクレベルでリピート配列と結合していることを示す実験を推進する。また、これらの遺伝子の発現がDM1患者の組織や他のリピート病の患者でどうなっているか解析する。
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| Causes of Carryover |
コロナの影響で遅延した実験と論文作成を次年度に遂行するため、科研費期間延長申請を行った。
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