2020 Fiscal Year Research-status Report
Treatable strategy for Dupuytren's disease using micro RNA technology
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19K09574
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
辻井 雅也 三重大学, 医学部附属病院, 講師 (40444442)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | デュピュイトラン拘縮 / 筋線維芽細胞 / 線維化 / 手外科 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
デュピュイトラン拘縮（DD）は手掌腱膜の肥厚と短縮により手指屈曲位を呈する原因不明の疾患である。治療は肥厚した腱膜の外科的切除か、コラゲナーゼ（collagenase clostridium histolyticum：CCH）注射による酵素溶解療法がある。しかしいずれの治療法でも、比較的高い再発率が報告されており、実際にCCH注射5年で47%の再発が報告され、再発の克服はDD治療の次の課題である。
DDでは再発機序だけでなく病態も未だ不明であるが、拘縮索で同定される特殊な線維芽細胞である筋線維芽細胞（myofibroblast: MF）が病態の主因と考えられており、このMF分化の抑制することで新たな治療方法を導入することが本研究の目的である。MFは拘縮索の中で結節部に存在するが、その起源は束部にも認めると考えている。その理由として手術では結節部を含めて切除するため、再発には切除腱膜の断端にある線維芽細胞の活性と分化が関連することが考えられるためである。実際に当科の先行実験で束部由来の細胞に線維化促進因子であるthrombinを添加することでMF分化が促進された。さらに束部由来再細胞はthrombin添加により遊走能やROS産生も増大させることも見出した。
また MF分化における遺伝子調節にmicro RNA (miRNA)の関与を考え、miRNA array解析をDD拘縮索の結節部と束部、また正常コントロールの3群で行い、miR-204とmiR-21の2遺伝子を同定した。この2遺伝子のうち、miR-21は一般のmiRNAとは異なり、むしろ高発現で疾患を促進する特殊なmiRNAで、心血管系疾患への関与やantagomir（拮抗遺伝子）の投与による間質の線維化抑制や心機能改善が報告されている。現在、thrombinに対する抑制効果や、miR-21の病態関与について実験を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
In vitroの実験は、2019年度にはDupuytren拘縮索の結節部と束部由来細胞にthrombin を1U/ml添加することで、Western blottingではα-SMA発現の増大を、scratch assayで遊走能増大を、さらにDCF-DA assayでROS産生の有意な増加を示した。しかしながら、α-SMA発現は束部由来の細胞では約3倍の発現増加があったが、結節部ではthrombinの投与にも関わらずα-SMA発現に差を認めなかった。そこで2020年度はDupuytren拘縮細胞に対してこれまでに報告のあるTGF-betaを添加の影響から検討を開始した。これまでと同様で10cmシャーレに結節部由来細胞と束部由来細胞を培養し、約80%程度となったところでstarvationを行い、24時間後にTGF-beta1を2 ng/mlで添加した。それによりwestern blottingでα-SMA発現は束部では約10倍、結節部でも約8倍と著明な増大を認めた。
切除標本を用いてのmiR-21の発現と局在についてはin situ hybridization（IHS）を3症例で行った。miR-21は主に結節部で発現しており、画像解析ソフトを用いてカウントしたところ、結節部の全細胞の81.3%に発現していた。また束部においても15.9%に陽性細胞を認めていた。一方、miR-204では筋線維芽細胞分化に抑制的に機能すると推測していたが、実際には結節部に高発現しており、病態への関与については不明である。
昨年度までの実験結果は以上のごとくであるが、現在のところ順調に実験は進んでおり、特にthrombinに関しては学会での報告も行っており、論文化に向けてin vitroの実験を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
In vitroの実験としては、2019年度はDupuytren拘縮（DD）細胞を用いて、結節部と束部由来細胞にthrombin を1U/ml添加することで、Western blottingではα-SMA発現の増大を、scratch assayで遊走能増大を、さらにDCF-DA assayでROS産生の有意な増加を示した。しかしながら、α-SMA発現は束部由来の細胞では約3倍の発現増加があったが、結節部ではthrombinの投与にも関わらずα-SMA発現に差を認めなかった。そのため筋線維芽細胞（myofibroblast: MF）へ効率的に分化させるために、これまでに報告のあるTGF-beta1を用いることを考えた。そこで2020年度はDupuytren拘縮細胞に対するTGF-betaを添加の影響から検討を開始した。これまでと同様で10cmシャーレに結節部由来細胞と束部由来細胞を培養し、約80%程度となったところでstarvationを行い、24時間後にTGF-beta1を2 ng/mlで添加した。それにより結節部も束部においてもwestern blottingでα-SMA発現は束部では約10倍、結節部でも約8倍と著明な増大を認めた。
切除標本を用いてのmiR-21の発現と局在についてはin situ hybridization（IHS）を3症例で行った。miR-21は主に結節部で発現しており、画像解析ソフトを用いてカウントしたところ、結節部の全細胞の81.3%に発現していた。また束部においても15.9%に陽性細胞を認めていた。一方、miR-204では筋線維芽細胞分化に抑制的に機能すると推測していたが、実際には結節部に高発現しており、病態への関与については不明である。
昨年度までの実験結果は以上のごとくであるが、現在のところ順調に実験は進んでおり、特にthrombinに関しては学会での報告も行っており、論文化に向けてin vitroの実験を進めている。
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