家族性膝蓋骨無形成症の新規原因遺伝子の同定と疾患発症機序の解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09585
• Research Institution: Aichi Medical University
• Principal Investigator: 高木 潤子 愛知医科大学, 医学部, 教授 (00319336)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 出家 正隆 愛知医科大学, 医学部, 教授 (30363063) ; 吉川 和宏 愛知医科大学, 公私立大学の部局等, 特務教授 (60109759) ; 高見 昭良 愛知医科大学, 医学部, 教授 (80324078)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 膝蓋骨無形成 / 原因遺伝子 / 歩行障害

Outline of Annual Research Achievements

本年度の目的は、骨形成異常を持つ患者家族に共通して認められた変異遺伝子について、変異を有する遺伝子と変異を有さない遺伝子発現系細胞をそれぞれ作製し、正常遺伝子と変異遺伝子により産生された分子の産生後蛋白修飾の違いについて検討することであった。また、ゲノム編集システムを用いて、遺伝子変異導入マウスを作成し、骨形成に対する影響を検討することであった。この遺伝子は、分泌蛋白をコードしており、細胞内で分子内切断され、切断により得られた成熟型小分子が細胞外に分泌され、機能する事が想像されている。見出した遺伝子変異により、そのコードするアミノ酸も変化しており、その変化により明らかな構造変化が見出され、変位遺伝子を持つ分子では細胞内切断をされる事ができなる事が予想された。そこで、変異遺伝子とその正常遺伝子の動物細胞発現用ベクターを構築し、それぞれの遺伝子を導入した細胞株を樹立し、産生される蛋白の成熟化のための切断の有無について検討することとした。これまで、成熟小分子を検出できる良い抗体が見つからず、その分子の検出に至らなかったが、検出できる抗体を得る事ができ、また、その成熟分子にtagを付けて発現する系も新たに作成し、成熟分子の検出が可能となった。その結果、正常遺伝子発現系細胞では、成熟小分子が認められるが、変異遺伝子発現系では成熟小分子は極めてわずかしか見出す事ができない事が明らかとなった。また、遺伝子変異導入マウスの作成については、委託により実施し、変異遺伝子導入マウスの作製ができている。現在ホモ、ヘテロに変異遺伝子を持つマウスの繁殖をしつつ、小動物用CTを用いて骨格系の形成異常について検討している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、変異遺伝子により産生された蛋白が成熟化のための切断という修飾が起きなくなることを確認することを目標として実施した。遺伝子変異を導入した細胞株樹立、また、成熟分子にtagを付けた分子の発現系を樹立でき、この分子を検出することのできる抗体とtagを検出できる抗体も得る事ができため、予定していた変異蛋白分子の修飾状況についての解析を進めることができた。また、変異遺伝子導入マウスの作製も問題なくでき、現在解析のための繁殖に到達することができた。

Strategy for Future Research Activity

令和３年度では、変異遺伝子導入マウスを繁殖させながら、ホモ、ヘテロ、野生型の遺伝子を有する各マウスにおける骨形成について、胎生期の各段階と成熟個体における形態の差異を解析する予定である。

Causes of Carryover

遺伝子組み換えにより、発現細胞培養による遺伝子機能の確認まで順調に進めることができたため、前倒し支払いを希望し、変異導入動物モデルの購入、飼育まで至ることができた。本年度では、前倒し支払いの残額を用いて、残りの研究計画を実施する。