2019 Fiscal Year Research-status Report
新規軟骨分化誘導転写因子EMX2を制御する分子間ネットワークの解明
| Project/Area Number |
19K09592
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
池田 敏之 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (80322759)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 軟骨分化 / 転写制御 / サイトカイン |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
発現制御メカニズム解明のため転写開始点上流4 kbから5’UTRを含むexon 1、イントロン1内1 kbの配列を、ルシフェラーゼ・レポーターアッセイにて解析・評価した。ベースの転写活性はプロモーター領域 4 kb のみ、およびプロモーター1 kb からイントロン1までを含むコンストラクトで強い結果であった。導入細胞種別でみると転写活性はHeLa, 293などがん細胞株では低く、C3H10T1/2, ATDC5, SW1353など間葉系・軟骨系の細胞株で高くなっていた。とくにイントロン1を含むコンストラクトに対する反応でこの傾向が顕著であり、イントロン1内に軟骨分化を制御するエンハンサー配列が存在するものと考えられた。一方SOX5, 6, 9（SOXトリオ）よる転写活性化は見られなかった。EMX2のSOXトリオによる誘導は直接の転写制御によるものではない、または解析対象としていなかったイントロン2や3’UTRに結合エンハンサーが存在するものと考えられた。
相互作用分子の候補として、SOXトリオのほか、RUNXファミリー分子、GATAファミリー転写因子、CEBPβ、p63/73などをピックアップし、293細胞をホストセルに強制発現系を用いたCo-IPを行ったが明らかな直接結合を認めなかった。
下流分子を検索するため、EMX2のアデノウィルス発現系を構築し、ヒト間葉系幹細胞に導入し軟骨分化誘導能を検証した。結果強い軟骨分化を生じRNA-seqやマイクロアレイなどの解析の系として適切であることを確認した。並行していくつかの候補分子をリアルタイムRT-PCRで解析し複数の下流分子を同定した。これらについて軟骨分化誘導能のスクリーニングをC3H10T1/2に対するレトロウィルス発現系で実施したところ、単独で弱い軟骨分化誘導能をもつサイトカインを新たに同定することができた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
転写制御の解析では、軟骨分化による転写制御の中心をイントロン1の1 kb 内の配列に絞り込むことができたが、一方でSOXトリオによる転写活性化部位を同定することはできず、イントロン2や3’UTRの追加の解析が必要となった。
選択的スプライシングの検討については、時間的・技術的制約があり初年度はexon 2の配列に対する欠失変異体を作成するところで終了し、実際の解析・検討に踏み込むことはできなかった。
相互作用分子については、候補分子を用いた解析では、明らかな直接結合分子を得ることはできず、ライブラリースクリーニングのためのベイトプラスミドの構築を行った。
下流分子の検索についてヒト間葉系幹細胞とアデノウィルス発現系を用いた軟骨分化誘導系は想定以上にうまくワークすることが明らかになった。また候補分子アプローチで軟骨基質や既知の転写因子以外の下流分子の情報も得ることができた。さらにはその機能解析で、直接軟骨再生医療につながりうる軟骨分化誘導能をもつ新規サイトカインの情報を得ることができた。
このように予定通りの部分、想定外の結果により追加の解析が必要となった部分、また想定以上の成果が得られた部分が混在しており、全体としておおむね順調な進捗状況と評価している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
プロモーターやイントロン領域に直接作用する転写因子を同定するため、RUNXファミリー、CEBPβ、GATA5、p63/p73の強制発現系と構築済みのEMX2プロモーター・レポーターベクターを組み合わせて、解析を行う。転写因子が同定されたら結合配列を絞込み、ルシフェラーゼ・レポーターアッセイのほか、EMSAを用いて検証する。SOXトリオの直接結合エンハンサー同定のためイントロン2、3’UTRの配列を用いた解析を追加する。
選択的スプライシングの検証のため、作成済みの欠失変異体を間葉系・軟骨系の細胞株に遺伝子導入しRT-PCRでスプライシング異常（exon skip）を認めるか検証、ESE（exonic splicing enhancer）同定を試みる。
EMX2の転写活性化を介した他分子との相互作用をみるため、作成済みのCOL2A1、SOX6プロモーター・レポーターベクターとEMX2の強制発現系を組み合わせ、EMX2の直接結合エンハンサーを同定する。同定した配列をベイトにファージディスプレイライブラリーを作用させ、EMX2と協調して働く転写因子の同定を試みる。
C3H10T1/2やSW1353へのHalo-tag-EMX2強制発現系、ヒト間葉系幹細胞へのMyc-tag-EMX2アデノウィルス強制発現系を用いpull-down assay を行う。得られた沈降蛋白をLC-MS/MSによる質量分析にかけ結合蛋白の情報を得る。
ヒト間葉系幹細胞へのアデノウィルスEMX2強制発現系を用いRNA-sequencingを行い下流分子の情報を網羅的に収集する。得られた分子の中からサイトカイン・リガンド・レセプターを抽出、C3H10T1/2へのレトロウィルス強制発現系で軟骨分化誘導能を検証し、軟骨再生薬の標的候補を得る。同定ずみの新規軟骨分化誘導サイトカインのファミリー分子も同様に解析する。
|
| Causes of Carryover |
初年度であり、費用のかかるRNA-シークエンス解析やライブラリースクリーニング、LC-MS/MSによる質量分析などの準備に向けた基礎的な実験系の構築に時間が必要であった。次年度使用額についてはこれら解析のため使用する予定である。
|
