2019 Fiscal Year Research-status Report

Epigenome-wide association study of human intervertebral disc degeneration

Research Project

Project/Area Number	19K09597
Research Institution	Mie University
Principal Investigator	明田浩司三重大学, 医学部附属病院, 講師 (20422826)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	奥村克純三重大学, 生物資源学研究科, 教授 (30177183) 島岡要三重大学, 医学系研究科, 教授 (40281133) 須藤啓広三重大学, 医学系研究科, 教授 (60196904)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	椎間板変性 / エピジェネティクス / DNAのメチル化 / RNAシークエンス
Outline of Annual Research Achievements	椎間板変性は遺伝性を背景に環境因子が影響すると考えられているが、その関連性は不明である。エピジェネティクスはDNAのメチル化修飾（DNAメチル化）を始めとした遺伝子発現を調節する機構であり、細胞分化や組織の安定化に寄与する。一方、DNAメチル化の異常は様々な疾患の発症に関連することが報告されている。しかし、これまで椎間板変性とエピジェネティクスの関連性は明らかになっていない。本研究の目的はヒト椎間板組織のエピゲノムワイド関連解析からDNAメチル化特性を椎間板変性度別に解析し、さらにRNAシークエンスよる網羅的mRNAの発現解析を行い椎間板変性の鍵となる候補遺伝子を同定することである。 RNAシークエンスよる網羅的mRNAの発現解析: DNAメチル化が変化した遺伝子が実際に発現変動を示すかを解析し、候補遺伝子の絞込みを行うことを目的とする。研究プロトコール：同一検体からmRNAを採取する。メチル化解析を行う全検体を用いてRNAシークエンスによるmRNAの網羅的発現量解析（株式会社アプロサイエンス）を行う。まず変性度別の遺伝子発現変動プロファイルの取得、発現変動遺伝子群のgene ontology解析を行う。DNAメチル化変化部位と比較解析を行うことで候補遺伝子の絞込みを行う。 2019年度は、ヒト椎間板サンプルからのmRNA抽出のプロトコールを確立した。次に、DNAメチル化解析を行ったヒト椎間板サンプルからmRNAを抽出することに成功した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 2019年度は、ヒト椎間板サンプルからのmRNA抽出のプロトコールを確立した。次に、DNAメチル化解析を行ったヒト椎間板サンプルからmRNAを抽出することに成功した。RNAシークエンスによるmRNAの網羅的発現量解析の調整中である。
Strategy for Future Research Activity	RNAシークエンスよる網羅的mRNAの発現解析(2020-2021年度): DNAメチル化が変化した遺伝子が実際に発現変動を示すかを解析し、候補遺伝子の絞込みを行うことを目的とする。研究プロトコール：同一検体からmRNAを採取する。メチル化解析を行う全検体を用いてRNAシークエンスによるmRNAの網羅的発現量解析（株式会社アプロサイエンス）を行う。まず変性度別の遺伝子発現変動プロファイルの取得、発現変動遺伝子群のgene ontology解析を行う。DNAメチル化変化部位と比較解析を行うことで候補遺伝子の絞込みを行う。 DNAメチル化とRNAシークエンスによる絞り込まれた椎間板変性に対する候補遺伝子を比較検討する。
Causes of Carryover	（理由）DNAメチル化の再検討を行う前に、既存のサンプルを用いたRNAシークエンスを行う予定に変更したため。（使用計画）RNAシークエンスによるmRNAの網羅的発現量解析費用に用いる予定