2020 Fiscal Year Research-status Report
iPS細胞由来多血小板血漿の開発と骨癒合促進効果に関する研究
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19K09615
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
志賀 康浩 千葉大学, 大学院医学研究院, 特任准教授 (90568669)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高山 直也 千葉大学, 大学院医学研究院, 講師 (10584229)
大鳥 精司 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (40361430)
折田 純久 千葉大学, 大学院医学研究院, 特任准教授 (60638310)
稲毛 一秀 千葉大学, 大学院医学研究院, 助教 (80793629)
曽根 正光 北海道大学, 低温科学研究所, 助教 (90599771) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | iPS細胞由来血小板 / サイトカイン / 骨癒合 / 骨形成促進 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和2年度も前年度からの継続研究を進め， iPS細胞由来人工巨核球・血小板凍結乾燥製剤の作成が安定的に作成可能となった．また，ラット腰椎癒合モデルおよび皮膚欠損モデルでの組織修復効果の検証を繰り返し，in vivoでの両評価系を確立してきた．さらに，レンチウイルスベクターを用いて人工血小板のもとになる巨核球株に骨癒合および創傷治癒促進効果が期待される因子（BMP2, VEGF, FGF2）を強制導入し，恒常的に過剰発現する不死化巨核球細胞株をそれぞれ作製した．恒常的な強制発現システムであるが，巨核球の成熟および血小板産生には影響しないこと，そして，大量の増殖因子（BMP2, VEGF, FGF2）が十分量放出されることをELISAを用いて確認した．
iPS人工血小板の特性解析も昨年度から継続実施してきたが，令和2年度新規成果として，別細胞株（MKCL21#）由来のiPS人工血小板凍結乾燥製剤を作成し，骨癒合促進に期待される複数因子の発現を確認し，また，ラット腰椎固定術モデルにおいて骨癒合・新規骨形成効果を調べた．結果，初回株同様に十分量の成長因子を含有し骨癒合促進・骨形成促進効果を有することが証明された．由来株が異なっても組織修復・再生効果を有しiPS人工血小板の有用性および普遍性が実証された．また，間葉系幹細胞（MSC）を用いた骨芽細胞分化系を確立し，iPS人工血小板製剤がMSCの骨芽細胞への分化促進効果を有することも確認した．
来年度へ継続する新規研究として，骨再生に関与する骨形成マーカー（osteocalcin, P1NP）および骨吸収マーカー(TRACP-5b, RANKL)に関して，移植後早期（4日，1週，2週）に免疫染色を施行することで，局所での骨代謝サイクルを客観的に評価し，より骨再生効果の高い製剤の開発研究に着手している．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前述の通り， iPS細胞由来人工巨核球・血小板凍結乾燥製剤の作成が安定的に作成可能となり，ラット腰椎癒合モデルでの使用確認を繰り返し，in vivoの評価系を確立出来た.
さらに人工血小板のもとになる巨核球株に骨癒合促進することが期待される因子（BMP2, VEGF, FGF2）を導入した株をそれぞれ作製し，製剤内の成長因子濃度が十分であることを確認できた
令和元年度の詳細な成果として，具体的にはiPS人工血小板の特性解析を実施し、骨癒合促進に関与が期待される複数因子の発現の有無を確認したこと，レンチウイルスベクターを用いて、骨癒合促進に関与が期待されるBMP2, VEGF, FGF2をさらに恒常的に過剰発現する不死化巨核球細胞株を樹立したこと，恒常的な強制発現システムであるが、巨核球の成熟および血小板産生には影響しないことを確認，これらの巨核球および血小板からは大量の増殖因子（BMP2, VEGF, FGF2）が放出されることをELISAを用いて確認したこと，間葉系幹細胞（MSC）を用いた骨芽細胞分化系を確立したこと，ラット腰椎癒合モデルを用いて、人工骨単独と比較してiPS細胞由来人工血小板のフリーズドライ製剤の有意な骨癒合促進を確認したこと等が挙げられる.
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、前年度までの研究内容の再現性を確認していくとともに,以下の計画を共同研究グループと共に遂行する予定である。
一つ目として，各高機能人工血小板を単独あるいは様々な比率で混ぜ，ヒト骨髄由来のMSCに作用させる.骨芽細胞への分化促進能力を骨芽細胞の初期マーカーであるALPの活性や骨分化マーカーの発現レベルのRT-qPCR解析を通じて、ハイスループットに評価し、骨化能力の最も高い高機能人工血小板の組み合わせ及びその混合比率を決定する.
さらには，各分泌因子の下流で活性化されるシグナル経路の阻害薬を用い，骨癒合促進に寄与するシグナルマップを作成しメカニズムを明らかにする.具体的に，骨再生に関与する骨形成マーカー（osteocalcin, P1NP）および骨吸収マーカー(TRACP-5b, RANKL)に関して，移植後早期（4日，1週，2週）に免疫染色を施行することで，局所での骨代謝サイクルを客観的に評価し，より骨再生効果の高い製剤の開発研究に着手している．
そして，上記スクリーニングで決定した有望な配合条件を候補として、ラット腰椎癒合モデルに適応し、in vivoでの評価を行う。マイクロCTスキャンにより手術部位を撮影し，骨形成体積定量と取り出した治療後の骨への3点屈曲試験方法を用いた機械的強度の定量測定を指標に評価する.同時に，腫瘍形成や過剰炎症・感染の有無を確認し安全性についても評価する．
上記基礎実験を重ね，将来的な人での臨床研究に応用できるトランスレーショナルリサーチトンして確立させていくのを目標とする.
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| Causes of Carryover |
今年度研究に関しては既存の研究物品および共同研究グループによる支払いでの対応がおおかった．次年度は，本助成金額から当初予定していた費用の多くの支出がある見込みである．
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Research Products
(5 results)
