2019 Fiscal Year Research-status Report
ヒアルロン酸レセプターCD44の断片化阻害による、軟骨細胞の脱分化抑制効果
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19K09620
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
高橋 伸典 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院講師 (20570196)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小嶋 俊久 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (70378032)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 関節軟骨変性 / CD44 / ヒアルロン酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、関節軟骨細胞の脱分化におけるCD44断片化の意義と断片化抑制による脱分化制御、変形性関節症発生抑制の可能性を探っている。
昨年度までにHCS（ヒト軟骨細胞様細胞株）および牛関節軟骨細胞におけるCD44の断片化モデルを確立し、HMG-CoA還元酵素阻害剤であるSimvastatinによるCD44断片化抑制による脱分化抑制効果、およびsiRNAによるRNA干渉実験系と阻害剤添加実験系において、ADAM10がCD44断片化に関わる主要なプロテアーゼであることを明らかにした。
過剰な力学的負荷が変形性関節症（OA）における軟骨変性に関連することが知られている。過剰力学的負荷による脱分化導入モデルにおいてCD44断片化が促進されることがウシ関節軟骨細胞で明らかとなり、ST140（STREX社）を用いた周期的伸展負荷によるCD44の断片化と脱分化導入は再現性をもって確立された。各種阻害剤の添加実験を行い、メカニカルストレスによるCD44断片化においてもADAM10がその主要なプロテアーゼであることが確認された。
牛関節軟骨細胞にCD44-ICD（細胞内断片）を強制発現させるとSox9をはじめとする関節軟骨細胞特異的遺伝子発現が抑制されたことから、CD44-ICD自体が脱分化導入を促進することが確認された。同時にOAモデルマウス（DMM：内側半月板不安定化モデル）作製技術を確立して、ADAM10の関節軟骨特異的ノックアウトマウス（Col2-Cre）におけるOA発生の抑制効果を確認しつつある。並行してより自然な関節軟骨変性モデルとして強制走行モデルについて検討を開始した。今後いずれかのOAモデルを用いてADAM10のOAにおける機能解析を進める予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ADAM10阻害（siRNAおよび阻害剤）によるCD44断片化抑制と脱分化抑制、さらにCD44-ICDの強制発現による脱分化導入効果が確認された。CD44の断片化および産生された細胞内断片（CD44-ICD）そのものが関節軟骨細胞に脱分化作用を及ぼすことがin vitroで強く示唆された。既にOAモデルをADAM10ノックアウトマウスで作成してADAM10のOA発生に対する重要性について検討を開始しており、データを蓄積しているがまだ不十分である。特にDMMモデルにおいては関節軟骨変性が強く現れすぎる傾向があり、より自然なOAモデルとして強制走行モデルについて検討を開始した。in vivoの検証系として、OAモデルマウスを用いた実験を継続して行う必要があるが、既に今年度までにモデルマウスの作成技術が確立されていることから、ADAM10の機能抑制（阻害剤の投与またはノックアウトマウス）が、OAモデルに対して与える影響についての検証をスムーズに進めることが出来る環境となっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度までにin vitroのデータが概ね出揃い、in vivoのデータも一部確認されつつあるので、来年度は引き続きin vivoの検証を中心に進める予定である。CD44の断片化抑制による、OAモデルマウスにおける関節軟骨変性の抑制効果を実証することが目的となる。具体的には二つのADAM10抑制モデルを用いる予定である。一つはADAM10阻害剤の関節内注射による、CD44の化学的断片化抑制モデル。もう一つはADAM10のノックアウトマウスを用いる系である。ADAM10阻害剤を用いる系、ノックアウトマウスを用いる系、いずれに対してもOAの導入方法としては内側半月板不安定化もしくは強制走行モデルを評価選択して用いる。
ADAM10のコンベンショナル・ノックアウトマウスは胎生致死であることが分かっており、関節軟骨特異的にADAM10をノックアウトするコンディショナル・ノックアウトマウスを用いる。ただしCol2-Creを用いたADAM10のホモ・ノックアウトマウスでは成長障害と短命を来すことが知られているため、場合によりCol2-CreERT2マウスを用いて成長終了後にADAM10欠損を誘導するモデルを使用することも検討する。
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| Causes of Carryover |
動物実験の進行が予定よりやや遅れたため、マウス購入を見込んだ予算に残金が発生した。
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