胞巣状軟部肉腫発症メカニズムの包括的解析

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09623
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 石黒 尚子 鳥取大学, 医学部, 助教 (50346350)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 軟部腫瘍 / キメラ遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

胞巣状軟部肉腫の原因遺伝子であるASPL-TFE3キメラ遺伝子は腫瘍特異的な転写因子として働き、その標的遺伝子は腫瘍の発生・進展において中心的な役割を果たすことが知られている。本研究課題は、ASPL-TFE3の標的遺伝子を網羅的に同定し過去の研究データと組み合わせることで、本キメラ遺伝子が発がんに導く分子メカニズムを包括的に明らかにすることを目的としている。本年度は、クロマチン免疫沈降シークエンス（ChIP-seq）法によるASPL-TFE3結合部位のゲノムワイドな検索を行った。
研究には、研究代表者が過去に樹立したヒト間葉系幹細胞株およびヒト胎児腎細胞のASPL-TFE3安定発現細胞株（FLAGタグ付き）であるUE7T/TR-AT細胞と293/TR-AT細胞を使用した。各細胞株において、テトラサイクリン添加によりASPL-TFE3/FLAG蛋白質を発現誘導し、ASPL-TFE3とゲノムＤＮＡをクロスリンクさせた。その後、酵素処理によりＤＮＡを５０～５００bp程度に断片化し、抗FLAG抗体を用いてASPL-TFE3と結合するゲノムＤＮＡ断片の免疫沈降をおこなった。このＤＮＡ断片を精製してリアルタイムＰＣＲ法により抽出ＤＮＡの評価を行ったところ、バックグラウンドが高いことが判明した。そこで現在、クロマチン免疫沈降法の至適条件の検討を行っている。
今後は、クロマチン免疫沈降法の条件検討を進め、さらにChIP-seqライブラリの作製、次世代シークエンサーを用いたＤＮＡ配列の読み取りを進めていく計画である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究の遂行中にサンプルを保存していたフリーザーが故障し、試料をつくり直す必要がでたため想定外の時間がかかってしまった。また、ChIP-seq法の至適条件の検討が難航していることから、当初の計画からやや遅れが生じている。

Strategy for Future Research Activity

ChIP-seq法の条件設定をさらに進め、その後、次世代シークエンサー解析によるＤＮＡ配列の決定、ゲノム上へのマッピングを行なうことでASPL-TFE3結合領域の同定を進めていく。至適条件の検討にさらに時間を要するようであれば、受託解析によるChIP-seqの実施も視野に入れて研究を推進することを計画している。

Causes of Carryover

次年度使用額が生じた理由は、研究計画の進捗にやや遅れが生じ、今年度に実施予定であった次世代シークエンサー解析が来年度に延期されたためである。
また使用計画としては、延期された次世代シークエンサー解析を来年度に実施するため、その費用に充てる予定である。