2019 Fiscal Year Research-status Report

転移性骨腫瘍に対するアクリジンオレンジ血管内投与の効果の検討

Research Project

Project/Area Number	19K09640
Research Institution	Akita University
Principal Investigator	土江博幸秋田大学, 医学部附属病院, 医員 (80513019)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	永澤博幸秋田大学, 医学部附属病院, 助教 (50375284) 宮腰尚久秋田大学, 医学系研究科, 准教授 (90302273)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	アクリジンオレンジ / ビスホスホネート / 転移性骨腫瘍
Outline of Annual Research Achievements	がんの骨転移はADLを大きく低下させ、進行を予防するために骨吸収抑制剤を一般に用いるが、完全に進行を抑えることは難しい。アクリジンオレンジは弱塩基性の蛍光色素であり、酸性物質に親和性をもつ特徴を有し、光エネルギーや放射線などを加えると、細胞をアポトーシスに導く作用を持つ試薬である。アクリジンオレンジはがんに特異的な親和性を有していることが判っており、血管内投与された骨肉腫モデルマウスの肺転移を抑制することが報告されている。アクリジンオレンジを血管内投与することで、転移病変を縮小させる効果が期待できるが、骨転移に対する効果はまだ検討されていない。さらに、骨吸収抑制剤との併用効果に関しては、全く調べられていない。そこで、マウスの脛骨に直接乳癌細胞を注射することで骨転移モデルを作成し、これらのマウスに対してアクリジンオレンジとビスホスホネートを投与する。具体的にはコントロール群、放射線単独群、アクリジンオレンジ投与＋放射線群、ビスホスホネート投与＋放射線群、アクリジンオレンジ投与＋ビスホスホネート投与＋放射線群の５群を用意し、それぞれ６週間飼育する。経時的なμC Tでの腫瘍サイズの評価と骨腫瘍周囲での組織染色・免疫染色での評価、μC Tでの骨形態計測を主な評価項目としている。本研究課題により、転移性骨腫瘍に対するアクリジンオレンジと骨吸収抑制剤の効果が明らかになれば、がんの骨転移患者におけるQOLをより高める事が期待できると考える。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason マウスの大腿骨に乳がん細胞株（E0771）を注入し、マウスの局所骨転移モデルを作成する必要があり、細胞株を実験に必要とするため、腫瘍細胞培養を行った。過去の報告に則って、10%ウシ胎児血清を加えたダルベッコ改変イーグル培地を使用し、抗生剤はカナマイシン(100μg/ml)を使用し、37度、5％CO2の加湿環境で維持。2継代目を大量に凍結保存することで、同一継代での実験が可能となった。 C57BL6マウスの膝蓋骨を脱臼させ、大腿骨への注射目標濃度である1.0×105個/10μLの細胞数を注射し、約３週間の飼育で骨破壊モデルを作成することができた。この骨破壊モデルマウスを使用し、アクリジンオレンジ単独群、ビスホスホネート単独群、アクリジンオレンジとビスホスホネート併用群、放射線照射単独群、コントロール群の５群に分けて６週間飼育している。６週間経過後はサクリファイスを行い、採血・遠隔転移の評価を含め、腫瘍の評価を行っている。このプロトコールを進行している段階である。
Strategy for Future Research Activity	今後はプロトコールを継続し、検体数を増やして、統計学的検討が可能な状態を目指す。具体的には各群でn=10を目標としている。各群の検体が集まり、サクリファイスが終了した後に、腫瘍部（大腿骨）のμC Tでの評価と骨形態計測や、組織学的検討を予定している。組織学的検討についてはビスホスホネートを評価するためのTRACP染色と、腫瘍勢い評価のためのMIB-1染色を予定している。
Causes of Carryover	プロトコールの確立、並びに骨転移モデルマウス作成が当教室では初回であり、時間を要したため、次年度まで実験が及んでいる。今後はマウス購入費、飼育費、細胞培養費、並びに各種評価のための検体処理費などに使用する予定である。特にµCTでの評価が予定よりも行われていないことなどから次年度使用額が生じています。現在プロトコールを進めていき、検体の採取が行われていくため、その分の費用が今年度にかかると考えられます。