2021 Fiscal Year Research-status Report
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19K09646
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
松下 雅樹 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院講師 (60721115)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鬼頭 浩史 あいち小児保健医療総合センター(臨床研究室), 臨床研究室, 副センター長 (40291174)
三島 健一 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (40646519)
長田 侃 名古屋大学, 医学部附属病院, 医員 (80815324) [Withdrawn]
神谷 庸成 名古屋大学, 医学部附属病院, 医員 (50845542)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | メクロジン / 軟骨無形成症 / FGFR3 / 低身長 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
乗り物酔い防止薬の成分であるメクロジンは軟骨細胞において線維芽細胞増殖因子受容体3（fibroblast growth factor receptor 3 : FGFR3） シグナルを抑制し、軟骨無形成症（achondroplasia：ACH）マウスモデルへの経口投与により骨伸長促進効果が認められている。これまでの研究で、7日齢のACHマウスモデル（Achマウス）に10日間メクロジンを投与したところ、1および2 mg/kg/dayで濃度依存性に骨伸長を促進した。令和元年度は、各種用量を投与し骨長を評価したところ、本プロトコールにおいてはメクロジン2 mg/kg/dayが、副作用が少なく最大限骨伸長効果を発揮できる用量と考えた。令和2および3年度は、メクロジン2 mg/kg/dayの有効性を検証するためにHypマウスの骨のosteoid volume/bone volume (OV/BV) を定量した。メクロジン2 mg/kg/dayはHypマウスのOV/BVを有意に減少させた。また、Hypマウスの成長軟骨における肥大軟骨細胞層は肥厚しているがメクロジン2 mg/kg/dayの投与により成長軟骨の構造を改善した。さらに、メクロジン2 mg/kg/dayの投与によりHypマウスの血清カルシウムおよびリン値を上昇させた。しかし、骨伸長促進効果は限定的であった。
メクロジンはFGFR3下流のERKのリン酸化を抑制することはこれまでの研究で分かっているが、令和元年度にcell freeキナーゼアッセイを行ったところ、メクロジンはMAPKカスケードにおけるMAP3K3のリン酸化を抑制することが示唆された。令和2および3年度には、胎生期マウス脛骨の軟骨を用いてRNAseqを行い、MAPK経路のうち、ERK経路およびp38経路に属する一部の遺伝子発現をメクロジンは抑制した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和元年度は、Achマウスにおいて2 mg/kg/dayがメクロジンの骨伸長効果を発揮する最も有効な投与量であることを示すことができた。令和2年度は、２mg/kg/dayのメクロジンを7日齢のHypマウスに同様のプロトコールで投与し、Hypマウスで増加しているosteoid volume/bone volume (OV/BV)や肥大軟骨細胞層の肥厚は減少した。また、メクロジンはHypマウスの血清カルシウムおよびリン値を上昇させたが、Hypマウスで上昇しているFGF23はさらに上昇した。一方、マイクロCTによる各種海綿骨や皮質骨のパラメータはメクロジンの投与により変化しなかった。令和3年度は、サンプルサイズを増やして検討したところ、メクロジン投与によるOV/BVの減少や肥大軟骨細胞層の厚みの減少は再現性が確認された。しかし、骨伸長促進効果は限定的であった。
令和元年度に行なったcell freeキナーゼアッセイによりメクロジンはMAPK経路においてMAP3K3のリン酸化を抑制することが示唆された。令和2年度には胎生期マウス脛骨の軟骨を用いてRNAseqを行った。FGF2により上昇した一部のMAPKファミリーカスケードに属する遺伝子発現を、メクロジンは抑制した。令和3年度にはMAPK経路のうち、ERK経路、p38経路、JNK経路に属する遺伝子のRNAseqを行ったところ、ERK経路およびp38経路に属する一部の遺伝子発現をメクロジンは抑制したが、JNKは抑制されなかった。cell freeキナーゼアッセイと胎生期マウス脛骨の軟骨を用いたRNAseqの結果に一部解離が認められる状態である。
以上により、本研究はおおむね順調に進んでいると考えているが、追加実験が必要な状態である。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究よりメクロジンはMAPK経路においてMEK1/2のリン酸化を抑制することが予想されていた。しかし、令和元年度に施行したキナーゼアッセイでは、メクロジンはMEK1/2のリン酸化抑制効果は軽度だったのに対し、さらに上流のMAP3K3のリン酸化を抑制することが示唆された。令和2年度は、胎児マウスの軟骨を用いてRNAseqを行ったところFGFR3シグナル亢進によって上昇した複数のMAPKファミリーカスケードに属する遺伝子をメクロジンが抑制することを示した。令和3年度は、MAPKのうち、ERKおよびp38経路に属する遺伝子発現はメクロジン投与により変動したが、JNKは変化しなかった。令和4年度には、軟骨細胞における細胞内シグナルの検討を行うために、Rat chondrosarcoma（RCS）細胞にメクロジンを添加した後にFGF2を加えFGFR3シグナルが活性化した一定時間後にMAP3K3やMAP2K6のリン酸化抑制効果の評価に加え、ERK、p38、JNK経路における効果をウエスタンブロッティング法により評価する。
Achマウスで最も効果を発揮するメクロジン2 mg/kg/dayは、Hypマウスにおいて有効は限定的である可能性が令和3年度までに判明した。令和4年には、サンプルサイズを増やしHypマウスにおけるメクロジンの有効性を示したデータを蓄積することで、FGFR3シグナルにおけるメクロジンの作用機序解明を目指す。
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| Causes of Carryover |
令和3年度は、胎児脛骨器官培養、RNA抽出、GSEA解析、マウスモデルへの投薬、組織学的検討を行った。マウスモデルへの投薬や組織解析のサンプル数はいまだ少ない状態である。また、作用機序に関してはGSEA解析を中心に行っていたため、軟骨細胞を用いた細胞内シグナルの評価は遅れていた。令和4年度には、さらにサンプル数を増やして組織学的検討やマイクロCT解析を行う予定であり使用額が生じる。また、軟骨細胞を用いて細胞内シグナルの検討を行うため、細胞実験のための培養液、FGF2、薬剤、ウエスタンブロッティングを行うための消耗品等が必要である。
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[Journal Article] Meclozine Attenuates the MARK Pathway in Mammalian Chondrocytes and Ameliorates FGF2-Induced Bone Hyperossification in Larval Zebrafish2022
Author(s)
G Takemoto, M Matsushita, T Okamoto, T Ito, Y Matsuura, C Takashima, T Yoshikawa, H Ebi, S Imagama, H Kitoh, K Ohno, Y Hosono
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Journal Title
Front Cell Dev Biol
Volume: 9
Pages: 694018
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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