腎前駆細胞の選択的抽出により機能的な構造を有する腎を再生するための基礎研究

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09678
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 中根 明宏 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (70464568)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西尾 英紀 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (10621063) ; 林 祐太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40238134) ; 安井 孝周 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40326153) ; 丸山 哲史 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 高度医療教育研究センター教授 (50305546) ; 水野 健太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70448710)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 再生医療

Outline of Annual Research Achievements

5% CO2、37°Cで、Glasgow MEMに10% FCS、10-4M 2-メルカプトエタノール、non-essential aminoacid、 1mM sodium pyruvate、1000U/ml LIF(leukemia inhibitory factor: ESGRO)を加えた条件で、Pax2 ES細胞を培養する。Pax2 ES細胞をLIFを除いた培養液中でhanging drop法を用い、胚様体(EB)を形成させた。5日後にEBを再度ディッシュに付着させ、10日目で分化したEBを0 .25%トリプシンEDTA溶液にて回収し、mRNAを抽出、回収した。回収したEBはRT-PCR法でPax2遺伝子が発現していることが確認できた。また他の腎発生の各段階で発現してくる遺伝子に変化がないかど うかをRT-PCR法を用い確認したところ、aquaporin-1、Integrin a8、BMP4、BMP7、Pax8、Podocinの発現上昇が認められた。
これらのEBをPax2発現細胞に対し、Pax2で標識した細胞を回収する条件でFACSを行い、細胞回収を行った。これらの細胞に対し、遺伝子の発現が上昇しているかをRT-PCR法で確認したところ、aquaporin-1の上昇が確認できた。aquaporin-1を用い、アクチビンA・RA非添加の条件下で分化させたPax2遺伝子を発現させたEBをPax2とaquaporin-1で二重標識し、FACSを行ったところ、両者の陽性細胞の増加を確認することができた。
以上より、中胚葉分化因子との協調により、腎を構成する細胞への分化が可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

FACSを行い、目的となる細胞の発現遺伝子は確認できた。他の遺伝子の発現がないかどうかの確認に移行している状態である。

Strategy for Future Research Activity

Pax2 ES細胞をから作成したEBにおいて、Pax2発現細胞をFACSすると、回収した細胞はRT-PCR法にてaquaporin-1の上昇が確認できた。しかし、その前段階において、他の腎発生の各段階で発現してくる遺伝子のIntegrin α8、BMP4、BMP7、Pax8、Podocinの発現上昇が認められているので、これらの確認も行なっていき、FACSの精度を高めて、目的の細胞を回収する条件を選定していくことが必要な状況である。

Causes of Carryover

腎・尿管発生に重要な遺伝子Pax2をES細胞に遺伝子導入し、培養・分化させる計画であったが、培養・分化が計画通りの結果が得られなかった。遺伝子導入や培養系の方法の見直しを行ったため、一時中断となった。このため次年度使用額が発生した。遺伝子導入・培養・分化は完結し、Embryoid body(EB)の遺伝子発現の確認を行っていきたい。