2019 Fiscal Year Research-status Report

Efficacy and toxicity of bladder instillation of anti-tumor peptide for inhibition of bladder tumor in mice

Research Project

Project/Area Number	19K09683
Research Institution	University of Tsukuba
Principal Investigator	島居徹筑波大学, 医学医療系, 客員研究員 (80235613)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	西山博之筑波大学, 医学医療系, 教授 (20324642) 小島崇宏筑波大学, 医学医療系, 准教授 (40626892) 吉川和宏愛知医科大学, 公私立大学の部局等, 特務教授 (60109759)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	膀胱腫瘍 / 機能性ペプチド / p16 / p14 / p19 / 膀胱移植モデル / 膀胱注入
Outline of Annual Research Achievements	ヒト膀胱癌株およびマウス癌細胞株におけるペプチド導入による増殖抑制をvitroで検討した。10種類のヒト膀胱癌株では株でp16とp14ペプチドの相乗抑制効果が認められた。マウス癌細胞株4株のスクリーニングでは、腎癌株、膀胱癌株の2株においてp16とp19(ヒトp14相同)ペプチドの相乗効果が認められ、膀胱注入で可移植性と考えられるMB49マウス膀胱癌株も含まれており、同株を用いた実験系が妥当と考えられた。ペプチド導入療法に先立ち、マウス膀胱移植モデルの生着可能性の検討を行った。C57BL/6マウス（メス）にマウス膀胱癌細胞株MB49を、あらかじめpoly-L-LYSINE(#P4707Sigma-Aldrich Japan)処理を行った膀胱内に、1x106個/0.1mlPBSを注入し、膀胱移植モデルの生着性を基礎的に検討した。その結果、経過を観察しえたマウス8匹中7匹に膀胱腫瘍の形成が認められ、本モデルを膀胱移植モデルとして応用することが妥当と考えられた。ペプチド導入による腫瘍抑制効果については、まずin vitroでペプチドを導入した細胞株を膀胱注入し腫瘍の生着が抑制されるかを検討した。MB491x106子/0.1mLPBSを上記同様の前処理をした膀胱に、ペプチド非導入細胞株(対照群)とペプチド導入群に分けて腫瘍形成を観察した。ペプチド導入群はp16群、p19群、p16+p19群の3群があり、各々8μMのp16あるいはp19ペプチド単独あるいはp16+p19ペプチドと2μM導入用ペプチドWr-Tを混合してin vitroで導入を行いその後膀胱注入を行った。結果は対照群は7/11匹で腫瘍形成。P16、p19、p16+p19群は各々3/10匹、2/15匹、1/14匹と腫瘍形成の抑制効果が認められた。今後再現性と膀胱移植後のペプチド膀注による治療を計画している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 当初の予定では、移植腫瘍に対する膀胱注入治療まで着手する予定であったが、研究代表者の異動と新型コロナ感染症拡大の初期フェーズが年度後半に重なり研究が一時停止したため。
Strategy for Future Research Activity	現在までのところ、マウス膀胱癌細胞株に対するin vitroでのペプチド導入後の増殖抑制実験は予定とおり終了したが、細胞周期関連分子の発現や動態に関して計画より遅延がある。一方、動物実験については計画していたモデルの確立が早期に終了し、その後のペプチド導入による腫瘍抑制実験まで進んでおり、期待した結果が得られているので、今後は基礎的検討にもどり、その後動物実験に移行する予定である。具体的には、まずin vitroの基礎実験において、マウス膀胱癌細胞株におけるペプチド導入後のp16、p19関連分子の変化、アポトーシス誘導の有無をwestern blotやTUNEL染色等で解析し、その後にマウス膀胱移植腫瘍モデルによるp16、p19ペプチドの全身投与による腫瘍抑制効果、毒性の解析を推進していく方策である。
Causes of Carryover	研究代表者の所属が異動となり、さらに新型コロナウィルス感染症拡大により、計画していた研究の一部が遅延したため。実施した研究の成果はほぼ計画通り得られているので、2020年度に研究環境と上記感染症の収束状況により、研究再開可能となれば計画通り使用されると見込んでいる。