2020 Fiscal Year Research-status Report
癌抑制遺伝子FLCNの代謝および膜輸送制御に着目した腎腫瘍化機構の解析研究
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19K09694
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
蓮見 壽史 横浜市立大学, 医学部, 助教 (40749876)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢尾 正祐 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (00260787)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 遺伝性腎癌 / BHD症候群 / FLCN/FNIP1/FNIP2複合体 / 細胞内輸送 / エピゲノム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昆虫細胞用にコドン最適化を行った配列を用いたpFastBacDualバキュロウイルス発現系でのFLCN/FNIP1複合体を、ゲル濾過にて大量精製し、神戸大学・仁田亮博士（研究協力者）の研究室にてネガティブステイン法を行い、比較的均一なFLCN/FNIP1複合体が得られていることが確認した後に、大型放射光施設Spring8にて、クライオ電子顕微鏡の撮影を行いましたが、クライオ電子顕微鏡にて、FLCN/FNIP1複合体の電顕像は得られなかったため、BS3含めた架橋剤などによる条件検討を行い、Spring8にて撮影することを数回繰り返しました。また、様々な複合体も構成蛋白を共発現させ、FLCN/FNIP1複合体のクライオ電顕の撮像を行っております。
また、pRosa26-Destを用いた、腎臓特異的Rab F-bp発現マウスが完成し、サザンブロッティングでRosa26プロモーター下の適切な位置にノックインされていること、Rab F-bpがマウス腎臓で発現していることを確認することができました。そこで、腎臓特異的Rab F-bp発現マウスと、腎臓特異的FLCNノックアウトマウスの交配を行いました。パイロットスタディーでは腎臓特異的FLCNノックアウトマウスに発生する多発嚢胞様腎の縮小は観察されず、腎臓特異的FLCNノックアウトマウスの生存期間への影響も観察されなかったため、母集団を増やして、さらなる観察を行っております。
またこれらが、臨床検体でどのようになっているか調べるため、BHD関連腎癌のシングルセル発現解析を行い、膜輸送関連の発現を見ると同時に、腫瘍微小環境へどのような影響を与えるかの解析を行っております。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Rab GTPアーゼ発現パネルを用いた蛋白-蛋白結合実験にて、様々なRab GTPアーゼがFLCNと結合することに明らかとなり、今後はそれらのFLCN結合RabGTPアーゼについて、その結合の生理的意義を調べております。
クライオ電子顕微鏡にて、pFastBacDualバキュロウイルス発現系にて得られたFLCN/FNIP1複合体を観察することができないため、FreeStyle293など他の発現系を用いる、他の既知の結合蛋白を共発現させるなどして、複合体のさらなる安定化を行っております。
また、腎臓特異的なRab F-bpの発現は、腎臓特異的FLCNノックアウトマウスに発生する多発嚢胞様腎や、腎臓特異的FLCNノックアウトマウスの生存期間へ影響を及ぼさなかったために、腎臓特異的なRab Fの発現が、腎臓特異的FLCNノックアウトマウスに発生する多発嚢胞様腎や、腎臓特異的FLCNノックアウトマウスの生存期間へ影響を及ぼすか調べております。
また、BHD関連腎癌のシングルセル解析では、膜輸送関連の遺伝子発現に変化が起きていることが明らかとなり、今後さらなる解析を進めます。
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| Strategy for Future Research Activity |
複数のRab GTPアーゼがFLCNと結合すること、及びその結合の強さがRab GTPアーゼ毎に異なること、BHD関連腎癌でそれらを含めた膜輸送をつかさどる遺伝子の発現が変化していることが明らかになりましたので、現在、それらの結合の生理的意義を調べております。具体的にはアミノ酸飢餓などに栄養状態を変化させることにより、Rab GTPアーゼとFLCNの共局在がどのように変化するかを中心に観察しております。
また、pFastBacDualバキュロウイルス発現系から得られたFLCN/FNIP1複合体を、クライオ電子顕微鏡にて観察することができなかったため、FreeStyle293発現系によるFLCN/FNIP1複合体の蛋白発現とその精製を行い、大量精製に成功するまでになっております。加えて、FLCNやFNIP1に結合することが報告されているAMPKやGABARPなどのFLCN/FNIP1複合体への取り込みを行い、複合体のさらなる安定化を行います。
腎臓特異的なRab F-bpの発現が、腎臓特異的FLCNノックアウトマウスに発生する多発嚢胞様腎や、生存期間へ影響を及ぼさなかったことから、同様の手法で得られる腎臓特異的Rab F発現マウスと腎臓特異的FLCNノックアウトマウスの交配を行っております。
また、BHD症候群のシングルセル解析から膨大なデータが得られたため、現在、膜輸送に関係する遺伝子を中心に、さらなる解析を行っております。
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| Causes of Carryover |
コロナで、12月末より実験器具のプラスチック製品が品薄状態になり、実験に使用する
チップが３月中に納入されなかった為次年度使用額が生じた。
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