2021 Fiscal Year Research-status Report
小胞体ストレスによる分子シャペロンの局在変化が胎盤形成不全に与える影響
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19K09784
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
池崎 みどり 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (40549747)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井原 義人 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (70263241)
岩橋 尚幸 和歌山県立医科大学, 医学部, 博士研究員 (50750907)
山本 円 和歌山県立医科大学, 医学部, 博士研究員 (70596973)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 小胞体ストレス / 分子シャペロン / カルレティキュリン / 胎盤形成不全 / シンシチウム化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
カルレティキュリン（CRT）は小胞体内で機能する分子シャペロンであるが、細胞膜表面や細胞外空間などにも存在する。CRTの小胞体シャペロンとしての機能は胎盤の正常な形成に必要であるが、細胞外のCRTが胎盤形成あるいは胎盤形成不全にどのように寄与するかは分かっていない。そこで、本研究では、細胞外CRTが胎盤形成不全にどのように関連するのかの解明を目的とした。妊娠高血圧腎症（PE）は胎盤形成不全を主病因とする疾患である。これまでの解析により、PE患者胎盤ではCRT発現量は変化しないが、PE患者血清中のCRTタンパク量は有意に上昇していることが分かった。また、PEや胎盤形成不全の一因である小胞体ストレス条件下では、細胞性栄養膜細胞のモデル細胞株であるBeWo細胞はCRTを細胞外へ放出した。さらに、小胞体ストレスを誘導したBeWo細胞由来のCRT含有培地を添加することにより、BeWo細胞においてフォルスコリン誘導性のシンシチウム化（合胞体化）が抑制されること、シンシチウム化の初期段階に必須であるE-カドヘリンの膜局在の低下とゴルジ体への集積が起こることも分かった。
これを踏まえ、令和3年度は、令和2年度までに観察されたCRT含有培地によるシンシチウム化抑制機構にCRT自体が寄与するのか、あるいはCRTと培地に含まれるタンパク質が結合することにより当該タンパク質の機能が何らかの影響を受けるためなのかを解明するため、大腸菌由来のリコンビナントCRTタンパク質の発現系および精製システムを確立した。リコンビナントCRTタンパク質を添加することにより、小胞体ストレス誘導下のBeWo細胞由来CRT含有培地と同様にE-カドヘリンのゴルジ体集積とシンシチウム化抑制がみられた。以上から、CRT結合タンパク質ではなく、小胞体ストレスにより細胞外に放出されたCRTそのものがE-カドヘリンの細胞内輸送を妨げることによりBeWo細胞のシンシチウム化を抑制することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
これまでの研究により、小胞体ストレスによりヒト胎盤モデル細胞からCRTが放出されること、CRT含有培地によりBeWo細胞においてフォルスコリン誘導性シンシチウム化が抑制されること、この時E-カドヘリンの正常な細胞内輸送が妨げられていることが分かった。低酸素ストレスは小胞体ストレスの一因であり、胎盤形成不全に深く関与する。令和3年度に低酸素ストレスによるCRTの細胞内局在変化について解析を行う予定であったが、研究遂行に想定以上に時間を要したため、本年度も引き続き解析を行う。また、我々は小胞体ストレスを誘導したBeWo細胞においてCRTが細胞膜上にも存在するという結果も得ている。細胞表面のCRTは特に癌細胞においてeat-meシグナルとして機能することが報告されているため、胎盤絨毛細胞においてもそのような機能を有するかどうかについて検証を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
低酸素ストレス条件下においても小胞体ストレス条件下と同様にCRTが細胞外へ放出されるか、また細胞膜表面へ移行するかについて、胎盤モデルであるBeWo細胞を用いて解析する。絨毛膜外栄養膜細胞モデルのHTR8/SVneo細胞では小胞体ストレス誘導によるCRTの細胞外放出や細胞膜移行の亢進は観察されなかったが、低酸素ストレス条件下における細胞局在の変化についてBeWo細胞と同様に検証する。
細胞膜上のCRTがBeWo細胞に与える影響については、蛍光標識したBeWo細胞に小胞体ストレス誘導剤で細胞表面にCRTを露出させた後、フォルボールエステルで分化を誘導したヒト単球様THP-1細胞と共培養し、BeWo細胞が貪食されたかどうかを蛍光観察法やフローサイトメトリーで評価する。
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| Causes of Carryover |
令和3年度において、新型コロナウイルス感染症蔓延のため研究遂行に想定以上に時間を要し、想定していた実験を十分に行うことができなかったことが、次年度使用額が生じた要因である。また、種々の実験に使用する試薬、抗体および細胞培養試薬、消耗品については、キャンペーンなどを利用するなどして節約に努めたため、当初の予定金額より支出は抑えられている。
令和4年度は、低酸素ストレスによるCRT局在の解析および細胞表面CRTの機能についての解析を行う。研究費の繰越分は、生化学・免疫学的解析に関連する研究試薬、低酸素培養キットの購入に使用する。また、国内外の学会における積極的な成果発表、研究成果の論文発表の為の掲載料等に使用する予定である。
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