2019 Fiscal Year Research-status Report
子宮内膜細胞診用液状検体の遺伝子検査を用いた漿液性腺癌検診の確立
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19K09795
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| Research Institution | Akita University |
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Principal Investigator |
佐藤 敏治 秋田大学, 医学系研究科, 助教 (70636183)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 直樹 秋田大学, 医学系研究科, 准教授 (40447199)
清水 大 秋田大学, 医学部附属病院, 講師 (60400503)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 漿液性癌 / 細胞診液状検体 / TP53変異 / 次世代シーケンサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、①TP53の遺伝子変異検出の単独で漿液性腺癌を診断することでコストを低減、②子宮内膜細胞診液状検体を使用することで、漿液性腺癌診断の感度・特異度を改善、③マイクロRNA検査で遊離DNA検出不能検体や前癌病変を予測できるかを明らかにすることである。癌だけでなく前癌病変をも診断し、単一の遺伝子検査(TP53変異)のみで診断でき、検査のための新たな装置や侵襲を必要としないことが本研究の独自性である。
本年度は、①細胞診用液状検体の採取・保存と②細胞診用液状検体からの遊離DNAの抽出の準備を行った。
本年度の当院で子宮全摘と卵管切除が施行される予定の患者で、本研究への参加に同意の得られた漿液性腺癌の症例は、子宮体部：1例、卵管・卵巣：7例（うち卵管上皮内癌1例合併）の計8例であり、キットの検体総数に満たないため、凍結保存とし来年度以降の検査予定とした。
遊離DNAの抽出準備として、遊離DNAの抽出は、QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit 50 prepsを、核酸吸着用の磁性ビーズスタンドとしてAdnaMag-SのQIAGEN社からのリースで調達した。TP53遺伝子変異のターゲットシーケンシングとして、Forshewら(Sci Transl Med. 2012)らがデザインしたTP53遺伝子変異のhot spotを全て含む16か所（Target Sequence：長さ150-200bp）を増幅するためのプライマーを注文した。
次世代シーケンサーを使用した遊離DNAの検出は、当施設のMiSeqを使用し着床前期胚の培養液中から行い、異数性の確認など既に実験系として確立した（課題番号：18H02942）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
遊離DNAの抽出は、QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit 50 prepsを使用予定であり、核酸吸着用の磁性ビーズスタンドとして使用予定のAdnaMag-Sは8検体ずつの使用のため、最大48検体を目標としている。本年度の当院で子宮全摘と卵管切除が施行される予定の患者で、本研究への参加に同意の得られた漿液性腺癌の症例は、子宮体部：1例・卵管・卵巣：7例（うち卵管上皮内癌1例合併）の計8例であり、キットの検体総数に満たないため、凍結保存とし来年度以降の検査予定とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き検体の集積を行う。8例程度でパイロットスタディを行い、検体採取時期・採取法・シーケンスの冗長度の最適化をする。検出可能と判断された場合、分子バーコードとsingle primer extensionを組み合わせたカスタムパネルを用いたNGS変異解析（QIAseq Targeted Panels）を行い、漿液性腺癌のcf-DNAのTP53変異検出による漿液性腺癌の感度・特異度を明らかにする。
上記が計画通り進まない場合に備え、①細胞診液状検体よりtotal RNA抽出し、microRNA検出パターンによるTP53変異の予測②登録症例のIn vitroで卵巣漿液性腺癌細胞の単離・培養を行い、腺癌細胞培養液中のcf-DNAのTP53変異検出感度とそのときの腺癌細胞のアポトーシス率の関係の検討も並行して行う。
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| Causes of Carryover |
本年度の当院で子宮全摘と卵管切除が施行される予定の患者で、本研究への参加に同意の得られた漿液性腺癌の症例は、子宮体部：1例・卵管・卵巣：7例（うち卵管上皮内癌1例合併）の計8例であり、キットの検体総数に満たないため、凍結保存とし次年度以降の検査予定とする。
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