2019 Fiscal Year Research-status Report

マイクロRNAを介した胎児胎盤母体間コミュニケーションメカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number	19K09821
Research Institution	Tokyo Medical and Dental University
Principal Investigator	宮坂尚幸東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (70313252)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	胎児胎盤系 / Nrk / マイクロRNA / 陣痛発来
Outline of Annual Research Achievements	＜分娩開始時期決定に関する胎児胎盤母体間情報伝達の動物実験モデルによる検討＞Nrk(Nik-related kinase)はX染色体上にコードされた遺伝子で、マウス胚体外組織から単離され、個体の発生過程で特異的に発現することが報告された。2011年、DendaらはNrkがマウス胎盤で高発現していること、マウスNrk欠損個体の初期胚を野生型メスマウスに移植すると、胎盤が肥大し分娩が起こらず死産となることを発表した。そこで申請者らは、胎仔／胎盤から母体へ向けて発出される分娩誘発シグナルに、Nrkが深く関連しているという仮説を立てた。今年度は、Nrkノックアウトのマウス系を確立し、その表現型として確かに分娩遅延が起きること、また胎盤が過形成になることを確認した。現在は我々の仮説を検証するために、Nrkノックアウトマウスと正常コントロールマウスの、胎盤における遺伝子発現の差異、胎児・胎盤から母体へのメッセンジャーとして機能している可能性が高い、母体血中に放出された胎盤由来マイクロRNAの差異の比較検討を進めている。＜分娩開始時期決定に関する胎児胎盤母体間情報伝達のヒト臨床検体による検討＞　ヒトにおいても分娩予定日を超過した過期妊娠は母児の予後が悪いことが知られている。マウスで見られた現象が、ヒト胎盤においても同様に起きているのか否かを、Nrk遺伝子のmRNA、蛋白レベルで確認し、さらにその下位遺伝子を同定することで、分娩誘発シグナルを検索することを目的としている。今年度は、正常ヒト胎盤について、HE染色・免疫染色・in situ hybridizationを行い、Nrkが絨毛合胞体細胞層に発現していることを証明することができた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ＜分娩開始時期決定に関する胎児胎盤母体間情報伝達の動物実験モデルによる検討＞ Nrkノックアウトマウスの作成手順を確立し、その繁殖に成功した。また、このマウスの表現型の特徴である分娩遅延が発生することを確認した。さらに、ワイルドタイプマウスおよびNrk ノックアウトマウスの胎盤を採取し、HE染色・免疫染色・in situ hybridizationを行うことで、胎盤の形態・Nrkの発現部位を比較し、Nrkノックアウトマウスにおける胎盤の過形成、およびワイルドタイプにおけるNrkの局在を確認することができた。またNrkのダウンストリームに存在すると推測されるMAPK経路、AKT経路のリン酸化について免疫染色を行い、Nrkをノックアウトすることで、その下流のどの経路に影響が出ているのかを明らかにした。Nrkノックアウトマウスと正常コントロールマウスにおける胎盤の遺伝子発現を比較するためのサンプリングはすで終了しており、今後RNAシークエンスによる比較検討を行う。＜分娩開始時期決定に関する胎児胎盤母体間情報伝達のヒト臨床検体による検討＞ヒト胎盤において、マウスと同様にNrkが発現しているか、もししているとしたらどこの細胞に発現しているかを明らかにすることを最初の目標とした。まず、陣痛の影響を受けていない、予定帝王切開で得られた胎盤を用い、HE染色・免疫染色・in situ hybridizationを行った。その結果、ヒトの胎盤にもNrk発現していること、そしてそれが栄養膜の合胞体細胞層に局在していることを明らかにした。ヒト胎盤におけるNrk評価方法が確立したため、今後は臨床的に異なる背景の胎盤（陣痛発来後の胎盤、自然陣痛が発来せずに分娩誘発を行った胎盤、分娩時週数の異なる胎盤など）におけるNrk発現の差異を比較検討できる状態となった。
Strategy for Future Research Activity	＜分娩開始時期決定に関する胎児胎盤母体間情報伝達の動物実験モデルによる検討＞ ①Nrkノックアウトマウスとコントロールマウスの胎盤のRNAシークエンス、②正常マウスを妊娠している正常雌マウスと、Nrkノックアウトマウスを妊娠している正常雌マウスにおける血清のRNAシークエンスを実施して、両者間で存在するマイクロRNA・発現遺伝子の差異を検出する。有意に差が見られたマイクロRNAまたは遺伝子の中から、胎児胎盤母体間情報伝達物質となっている可能性のある物質をバイオインフォマティクスを用いて推測する。胎児胎盤母体間情報伝達物質となっている可能性のある物質の働きを阻害することにより、Nrk ノックアウトマウスの表現型である分娩遅延が起こることを確認する。また同物質を早産モデルマウスに注入することで早産を予防できるかを実験する。＜分娩開始時期決定に関する胎児胎盤母体間情報伝達のヒト臨床検体による検討＞臨床的に異なる背景の胎盤（陣痛発来後の胎盤、自然陣痛が発来せずに分娩誘発を行った胎盤、分娩時週数の異なる胎盤など）において、Nrk発現の差異を免疫染色、in situ hybridization、定量的PCRなどにより確認する。またヒトにおいて、上記マウスモデルで推定された物質が人間にも存在することを確認する。ヒトにおいてもマウスと同様の働きがあると推定される場合には、ヒト血液・尿・唾液などの比較的侵襲が少なく採取できる臨床検体中の濃度をELISA法やqPCRを用いて測定する。同物質の量と陣痛発来の相関関係を明らかにすることで、陣痛発来の時期の推定の一助とする。また早産や過期産などの病的症例においても濃度変化を把握することで、病態解釈に役立てる。最終的には、早産が予測される症例に対して同物質を投与することで早産を予防または治療する薬剤としての活用も期待される。
Causes of Carryover	＜動物実験モデルによる検討＞昨年度はNrkノックアウトマウスの表現型である分娩遅延により死産が多発したため、マウスの繁殖・サンプリング収集に当初の予想以上の期間が必要となった。マウスの交配を増やすことにより、サンプリング数を増やした。今年度まとめてRNAシークエンスを行うこととなったため、昨年度予算を繰り越した。今年度はNrkノックアウトマウスと正常コントロールマウスにおける胎盤の遺伝子発現を比較するためにRNAシークエンスを施行する。またRNAシークエンスにより推定された胎児胎盤母体間情報伝達物質となっている可能性のある物質の局在を調べるために免疫染色・in situ hybridizationを、妊娠時期による発現量の測定のためにELISA法やqPCRを行うため、必要な試薬を購入予定である。＜ヒト臨床検体による検討＞ヒト検体のサンプリングを多数施行予定のため、それに伴う中性緩衝ホルマリン・PFAなどの固定液、免疫染色・in situ hybridizationに必要な試薬の購入を追加する予定である。Nrkの発現量の変化を測定するためにqPCR用の試薬も必要である。また、マウスモデル実験により推定された胎児胎盤母体間情報伝達物質をヒトにおいても検出するため、免疫染色のための抗体、in situ hybridization・qPCRのためのプローブ作成費用が必要となる。