視床下部性性腺機能抑制における視索前野領域ミクログリアの役割の証明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09836
• Research Institution: St. Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 藤岡 仁美 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (50410064)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 萩原 裕子 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助教 (90468207)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: GnRH / ストレス / ミクログリア / Kisspeptin

Outline of Annual Research Achievements

機能性視床下部性性腺機能低下はストレスと関連があることが知られている。申請者らは先行研究で、感染ストレス負荷により、終板器官(OVLT)のミクログリアでのIL-1βの発現増加と、LHサージ状分泌の抑制が並行して起こり、ミクログリア/MΦ活性化阻害でこれらが回復することを明らかにした。しかし、ミクログリアのGnRHおよびLHサージ状分泌抑制への関与の証明にまでは至っていない。本研究はこの結果を更に発展させ、「OVLTのミクログリアの活性化が視床下部レベルで作用しGnRH/LHサージ状分泌を抑制する」との仮説をたて、これを検証することを目的とした。
令和2年度は、ケモジェネティックにミクログリアの活性化を抑制する系として、ミクログリア/MΦ系細胞特異的にhM4D(Gi)を発現する組換え遺伝子を持つアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター(AAV CD68-hM4D(Gi)-mCherry) の使用を検討した。上記ウイルスベクターをAddgeneより入手し、Wistar-Imamichi系ラットのOVLTに投与した。つづいて、組換え遺伝子の発現を確認するため組織学な検討を行ったが、mCherryの発現はミクログリアではなく、ニューロン様細胞で観察された。この結果より、少なくともWistar-Imamichi系ラットでは上記のAAVを用いたミクログリアの操作は難しく、他の系の検討の必要性が示された。
今後、LE-Tg(OTTC1005) CX3CR1-Cre-ERT2ラットを用いた検討を行う予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

令和２年度は、LE-Tg(OTTC1005) CX3CR1-Cre-ERT2ラット(ミクログリア/Mφ系細胞でタモキシフェン誘導によりcreリコンビナーゼが活性化)を、利用可能になり次第RRRCから購入し、DREADDによるミクログリアの活性化をコントロールした実験を行う予定であった。
しかし、米国での新型コロナウイルスの流行の影響で、RRRCでのLE-Tg(OTTC1005) CX3CR1-Cre-ERT2ラットの繁殖が縮小されていたことなどがあり、本学導入への導入が遅れた。さらに、本邦での新型コロナウイルス感染拡大の影響で、研究者所属大学でも特に学生教育面での対応に追われ、研究エフォートの減少が研究の進捗にも悪影響を与えた。現在、導入したラットを交配し、実験用に動物の繁殖を行っている。

Strategy for Future Research Activity

令和３年度は、LE-Tg(OTTC1005) CX3CR1-Cre-ERT2ラットでのCreERT発現のミクログリア特異性の検討を行った後、速やかにDREADDによるミクログリアの活性化をコントロールした実験を行う予定である。

Causes of Carryover

令和２年度は、ラットへのウイルス投与の条件検討および組織・形態的な研究を主に行ったが、予定していた遺伝子組換え動物の導入が遅れたため、計画していた実験試薬・投与ウイルスなどの購入費の一部が次年度に繰り越し、次年度使用額が生じた。