Development of new diagnostic methods by extracellular vesicles in nasal lavage fluids

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09843
• Research Institution: Shiga University of Medical Science
• Principal Investigator: 清水 志乃 滋賀医科大学, 医学部, 医員 (50505592)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: エクソソーム / 鼻腔洗浄液 / 鼻茸線維芽細胞 / 好酸球 / 慢性副鼻腔炎 / アルツハイマー病

Outline of Annual Research Achievements

平成31年度は、倫理審査委員会の承認を得て、鼻腔洗浄液の回収を行い、エクソソームの測定を行った。洗浄液中にはすべてのサンプルにエクソソームが含まれていた。鼻茸由来の鼻茸線維芽細胞を培養し培養上清を回収した。鼻茸線維芽細胞は無刺激でも培養上清中にエクソソームを放出していることを確認した。濃度測定にはELISA法を用いた。また高濃度のエクソソームを回収するために長期に鼻茸線維芽細胞を培養し、超遠心法あるいは市販の回収キットを用いて培養上清中のエクソソームを濃縮回収した。フローサイトメトリーでエクソソームの検出を試みた。検出キットを用いることで検出は可能であったが、好酸球との共培養での濃度の変化を見るにはその精度、実験に必要な時間、コスト面から適当でないことが分かった。今後はフローサイトメトリーを用いた別の検出方法を検討したい。培養上清中にエクソソームが含まれることを示すために、濃縮したエクソソームをNanoSightあるいは電子顕微鏡で計測した。超遠心法と市販の回収キットのどちらでも十分なエクソソームを回収できていることをNanoSightで確認し、より高濃度で回収できた超遠心法のサンプルを用いて電子顕微鏡でエクソソームを撮影した。
本研究は鼻腔洗浄液を用いて鼻粘膜における細胞外小胞の測定法を確立し、鼻副鼻腔疾患や中枢性疾患の診断や病態解明に利用することを目的としている。次年度はさらにサンプル数を増やし、鼻茸線維芽細胞が放出するエクソソームの役割について研究を進めたい。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

患者検体の収集は予定通りに進んでいる。
培養細胞由来のエクソソームの濃縮・回収も予定通り進行している。
エクソソームの検出はフローサイトメトリーでの検出に難渋している。

Strategy for Future Research Activity

患者検体の収集がコロナウイルス感染症の広がりの影響を受けて中断している。臨床検体を用いた検討は現在の検体で続行し、状況が改善し次第検体数を増やしていきたい。
培養細胞を用いた検討はエクソソームの組織リモデリングにおける役割について検討する予定である。

Causes of Carryover

残額は次年度の消耗品購入に充てる予定である。