2020 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of mucosal immune responses in airway system by aging
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19K09872
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
平野 隆 大分大学, 医学部, 講師 (20305056)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安倍 伸幸 大分大学, 医学部, 客員研究員 (10433054)
鈴木 正志 大分大学, 医学部, 教授 (60211314)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 加齢 / 粘膜免疫 / インフルエンザ菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
5週令から１年までのBALB/cマウスを用いて検討を行った。まずは、経時的な免疫応答に対する変化を観察するために、5週令、６ヶ月および１年令マウスにインフルエンザ菌由来の外膜蛋白(OMP)を用いて免疫を行なった。各マウスから、中耳 骨胞、鼻粘膜組織、鼻粘膜関連リンパ組織(NALT)、肺、頚部リンパ節を採取して、中耳骨胞はコラゲネース処理を行い、他の組織はスチールメッシュ処理により細胞レベルまで組織を粉砕している。中耳組織以外の粘膜組織においてはパーコールによる2層比重遠心法により単核球を採取しており、NALT、頚部リンパ節 などのリンパ組織はスチールメッシュ処理で得られた試料を用いて解析を行っている。得られた試料は、T細胞の解析を行うため、各組織から採取した単核球を蛍光標識したFITC標識抗マウスCD3a抗体Pacific Blue標識抗マウスCD4抗体、PE-Cy7標識抗マウスCD8a抗体、APC-Cy7標識抗マウスCD44抗体、PerCp標識抗マウスCD62L抗体（全てBioLegend社、CA、USA）を用いて単核球を染色し、T細胞の分画およびCD４陽性ヘルパーT細胞の分化について検討を行った。また、鼻腔洗浄液や血清を採取し、OMP特異的IgAおよびIgG抗体価を測定した。各試料から得られた単核球数においては、加齢に伴う変化はあまり認められなかった。しかし中耳組織、鼻粘膜組織においては、OMPの経鼻免疫後では、５週齢マウスではエフェクターT細胞比は増加するが、加齢に伴い反応性は減弱していた。メモリーT細胞比は加齢に伴い全体的に増加し、 頸部リンパ節以外はナイーブ T細胞比は減少する傾向を認めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
加齢に伴う変化について、中耳組織、鼻粘膜組織、鼻粘膜関連リンパ組織(NALT)、肺、頚部リンパ節での解析を行っており、加齢にともなう免疫系の機能変化 は総じて免疫老化については、T細胞などの主要な免疫系細胞は量的には加齢に伴ってほとんど変動することはないと報告されているように、今回の実験経過に おいても上気道粘膜免疫に関わるT細胞においても概ね同様の傾向である事が示されている。しかし、OMPによる粘膜免疫における応答には加齢に伴う変化を認める。今後は加齢に伴う鼻咽腔や中耳におけるインフルエンザ菌クリアランスにおける影響について検討する。
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| Strategy for Future Research Activity |
５週齢~12ヶ月齢BALB/cマウスを用いて、インフルエンザ菌由来蛋白抗原を粘膜アジュバントとともに経鼻、経口、経気管、経皮投与群の作成を行う。免疫後 に血清、鼻腔洗浄液、中耳洗浄液を採取後、上記で示したように、各種臓器における細胞生物学および学的分子生物学的解析を行う。上記組織において、コラゲ ネース処理や比重遠沈法などにより単核球を採取して、B細胞の解析を行うため、 FITC標識抗B220抗体、PE-Cy7標識抗CD19抗体、APC標識抗CD22抗体にて染色を行い、フローサイトメトリーによるB細胞分画の解析を行い、 B220陽性B細胞、CD11b陽性顆粒球、CD11c陽性樹状細胞などの活性化についても解析する。またセルソーターを用いて各臓器よりT細胞分離後にRNAを抽出し、innate and adaptive immune responses PCR arrayを施行し、Tリンパ球のカスケードをRNAレベルから解析し、免疫応答でのカスケードの解明および細胞内シグナル伝 達の解析を行い、加齢に伴う免疫誘導に関与する因子について継続的に研究を行う。粘膜組織、リンパ組織からT細胞分離後、feeder細胞と共に抗原刺激を加え培養し、MTT assay によるT細胞proliferation解析を行い、ELISAなどによる抗原特異的抗体価測定、抗原特異的抗体産生細胞数をELISPOT法にて計測しなどを行う。血清、中耳、鼻 腔洗浄液中のTNF-α、IL-1β、IL-4、IFN-γ、IL-6、IL-10、TGF-β、IL-17といったヘルパーT細胞、制御性Tリンパ球やTh17細胞の分化に関与する各種サイトカ イン濃度を測定し、免疫応答におけるサイトカインネットワークについて調べる。
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| Causes of Carryover |
コロナ感染の世界的流布により国際学会などに参加できなくなったため、残金が生じている。また、使用計画としては残金が少ないので文献を収集したり、論文校正に使用する予定である。
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