2019 Fiscal Year Research-status Report

Regulation of the ciliary beat by intracellular Ca2+ oscillation in the nasal epithelial cells

Research Project

Project/Area Number	19K09879
Research Institution	University of Occupational and Environmental Health, Japan
Principal Investigator	鈴木秀明産業医科大学, 医学部, 教授 (20187751)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	大淵豊明産業医科大学, 医学部, 講師 (00412651)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	線毛運動 / 鼻粘膜 / 細胞内Ca / 単離細胞 / Fluo-8 / 高速フーリエ変換 / 振動
Outline of Annual Research Achievements	（１）下鼻甲介切除術で切除したヒト鼻粘膜を培養液中に浸し、直ちにブラッシング法により上皮細胞を剥離させ単離した。単離細胞の懸濁液をゼラチンコートまたはコラーゲンコートしたディッシュに移して偏光顕微鏡で観察した。活発な線毛運動を示す線毛上皮細胞が確認できたが、ディッシュ底面に十分貼り付かず、線毛運動速度の測定が困難であった。（２）そこで、整形外科領域のテーピングで用いられるアドヘッシブ・スプレーをディシュ底面にスプレーして単離細胞の懸濁液を加えたところ、細胞はディシュ底面に比較的良く貼り付き、これをハイスピードビデオカメラで録画して線毛運動を測定することができた。（３）次にこの単離線毛上皮細胞懸濁液に細胞内Ca蛍光指示薬（Fluo-8, 5 μM）を加え、室温で３０分間incubateした後、倒立蛍光顕微鏡（Carl Zeiss Axioskop 2 Plus；現有設備）に付属したハイスピードビデオカメラ（DITECT HAS-D71）で録画した。録画速度は毎秒100フレーム（シャッタースピード1/100秒）とした。（４）録画したビデオを解析し、線毛運動速度とFluo-8の蛍光測定した。線毛運動速度は4～6 Hzであり、以前われわれが鼻粘膜組織片で測定した6～12 Hzよりも低い値となった。一方、Fluo-8の蛍光の変化は非常に微弱であり、noiseによるゆらぎと区別することが難しかった。（５）そこでFluo-8の蛍光の周期的変化について高速フーリエ変換による解析を行った。しかし、線毛運動速度と同期する周波数のピークは検出できなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason （１）本研究に着手するにあたり、今回、初年度の予算で高感度ハイスピードカメラ（DITECT HAS-D71）を購入した。予算がぎりぎりであり、購入時の交渉に時間を要した。（２）上記の購入で予算を使い切ったため、Fluo-8をはじめとする試薬類、溶液、またディシュなどの消耗品を購入するための予算を確保するのに時間を要した。（３）単離細胞がディシュ底面に貼り付いた状態で観察・録画する必要があり、ゼラチンコートやコラーゲンコートのディシュを使用してみたが、線毛細胞がうまく貼り付かず、線毛運動に伴って動き回るため、高速度ビデオ撮影や測定が困難となった。いろいろな工夫を試みた結果、テーピング用のアドヘッシブ・スプレーを使用することにより解決できた。（４）1/100という短いシャッタースピードでFluo-8の蛍光が検出できたが、蛍光の変化が微弱であり、高速フーリエ変換による解析を行っても線毛運動速度に一致する周期的な変化が検出できなかった。
Strategy for Future Research Activity	（１）細胞内Caの周期的変化が検出できなかったことは想定外であった。今年度は膜電位の蛍光プローブを用い、同様の実験系で周期的な変動を調べる予定である。膜電位プローブとしては、蛍光共鳴エネルギー移動を利用した分子プローブ（DiO/DPAなど）や電場の変化に伴って蛍光特性が変化する分子プローブ（di-4-ANEPPS）などを用いる。（２）単細胞生物の鞭毛に、ヒトのT型電位依存性Caチャネルの相同分子が発現し、鞭毛運動を制御しているとの報告を見出した（Current Biology 19: 133-139, 2009）。T型電位依存性Caチャネルは洞房結節や神経細胞において周期的な細胞内Caの波動を発生させることが知られている。この分子が気道上皮細胞の線毛に発現していれば非常に興味深い。われわれは予備実験でT型電位依存性Caチャネルが免疫組織学的に鼻粘膜上皮の表面に発現しているデータを得た。この分子について、免疫電顕、RT-PCR、薬理学的な線毛運動抑制試験、さらに（１）で述べた膜電位イメージングにより探求していく予定である。