スーパーエンハンサーを介した遺伝子発現制御によるHPV関連中咽頭癌発癌機構の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09895
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 佐野 大佑 横浜市立大学, 医学部, 講師 (10620990)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 波多野 孝 横浜市立大学, 附属病院, 助教 (40807583) ; 折舘 伸彦 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (90312355)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: HPV関連中咽頭癌 / スーパーエンハンサー / 遺伝子発現制御

Outline of Annual Research Achievements

本研究は，HPV関連中咽頭発癌機構における，スーパーエンハンサーを介した遺伝子発現 制御の詳細を明らかにするために以下の研究を行う。1. ChIP-seqによるHPV関連中咽頭癌細胞におけるスーパーエンハンサーの同定　2. スーパーエンハンサーにより発現制御される遺伝子の機能解析　3. スーパーエンハンサー阻害剤，ならびにスーパーエンハンサー領域を欠失させた際の影響

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

令和1年度はHPV関連頭頸部癌細胞株を用いて，スーパーエンハンサーの構成因子に対する抗体によるChIP-seqを行い，HPV関連中咽頭癌細胞におけるスーパーエンハンサーの局在を調べる予定であったが，ChIP-seqを行うための準備に時間を要しているため，本課題で行う予定であったアプローチではなく，Open databaseを用いたバイオインフォマティクスのアプローチにより，HPV関連中咽頭癌の発がん機構の調節を担っている遺伝子同定（遺伝子X）を試みている。

Strategy for Future Research Activity

上記のように同定されたX遺伝子について，臨床検体における発現，細胞株におけるX遺伝子の発現抑制，ならびに強制発現による影響の検討を行う。まずゲノム編集手法であるCRISPR/Cas9法を用いて，X遺伝子をknockoutしたHPV関連頭頸部癌細胞株を作製 し，proliferation assay，migration assay, フローサイトメトリーを行うことで，細胞増殖，遊走能，アポトーシスについてコントロール細胞株と比較検討する。続いてCRISPR/Cas9法を用いて，X遺伝子をknock-inしたHPV関連頭頸部癌細胞株を作製し，同様にproliferation assay， migration assay, フローサイトメトリーを行うことで，細胞増殖能，遊走能，アポトーシスについてコントロール細胞株と比較検討する。さらにHPV関連中咽頭癌臨床検体における，X遺伝子がコードするタンパク発現の予後における寄与について，当施設で手術加療を施した頭頸部癌 患者の検体におけるX遺伝子がコードするタンパク発現の免疫組織学的評価をし，全生存期間との相関について調べる。
続いてスーパーエンハンサーの不活化による影響の検討を，スーパーエンハンサーを構成するBETファミリー蛋白を阻害する薬剤の一つで用いることで，X蛋白発現と細胞増殖能，遊走能，アポトーシスへの影響を調べる。さらにX遺伝子上流に存在するスーパーエンハンサー領域にガイドRNAを設計したCRISPR/Cas9法により，HPV関連頭頸部癌細胞におけるスーパーエンハンサーを欠失させ，その際のX遺伝子発現，細胞増殖能，遊走能，アポトーシスへの影響について調べる。

Causes of Carryover

当初予定していた解析を行わなかったため次年度使用額が生じた。

Research Products

• [Journal Article] Real-world Treatment Outcomes of the EXTREME Regimen as First-line Therapy for Recurrent/Metastatic Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: A Multi-center Retrospective Cohort Study in Japan (2019)
  • Author(s): Sano D, Fujisawa T, Tokuhisa M, Shimizu M, Sakagami T, Hatano T, Nishimura G, Ichikawa Y, Iwai H, Oridate N
  • Journal Title: Anticancer Research Volume: 39 Pages: 6819-6827
  • DOI: 10.21873/anticanres.13898
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Addition of S-1 to radiotherapy for treatment of T2N0 glottic cancer: Results of the multiple-center retrospective cohort study in Japan with a propensity score analysis (2019)
  • Author(s): Sano D, Tanabe T, Kubota A, Miyamoto S, Tanigaki Y, Okami K, Komatsu M, Ikoma R, Suzuki K, Akazawa Y, Kobayashi S, Yamada Y, Oridate N
  • Journal Title: Oral Oncology Volume: 99 Pages: 104454
  • DOI: 10.1016/j.oraloncology.2019
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Treatment outcome of the EXTREME regimen as first-line therapy and nivolumab as second-line or third-line therapy for recurrent/metastatic head and neck squamous cell carcinoma in a multiple-center study (2019)
  • Author(s): Sano D, Tokuhisa M, Ichikawa Y, Oridate N
  • Organizer: The 57th Annual meeting of Japanese Society of Clinical Oncology
  • Int'l Joint Research