2019 Fiscal Year Research-status Report
バイオインフォマティクスに基づくオプトジェネティクス遺伝子の開発
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19K09945
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| Research Institution | Iwate University |
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Principal Investigator |
菅野 江里子 岩手大学, 理工学部, 准教授 (70375210)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
富田 浩史 岩手大学, 理工学部, 教授 (40302088)
田端 希多子 岩手大学, 理工学部, 特任准教授 (80714576)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | オプトジェネティクス / 神経細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
自然界にあるアニオンチャネルロドプシンとして、多波長型GtACR1や青型GtACR2が広く知られている。我々が開発したアニオンチャネルロドプシンは、GtACR2と同様に青色に感受波長ピークを持つが、その感受波長域は、GtACR2に比べて各段に狭く、特にUV領域には応答しない。UV光で刺激する系は、光刺激自体の細胞への毒性が高く、応用が難しい。この点において、我々の開発したアニオンチャネルロドプシンは、神経細胞へのオプトジェネティクスの応用に有効であると考えられる。
また、開発したアニオンチャネルロドプシンは、チャネルの閉口速度が、GTACT2に比べて有意に速い。チャネルの開閉速度は、神経細胞に用いる場合、神経細胞の応答速度に重要な役割を持つ。特に閉口速度は、次の興奮に対し反応するために、そのスピードが要求される。これは、反応特性（Hz）と関連し、神経細胞の活動を伝えるために重要である。
本研究の中で、機能予測を用いて開発したアニオンチャネルロドプシンの様々な変異体を作製している。その中で、1アミノ酸の変異によりチャネル活性がなくなることを見出しており、これらの検討から、クロライドイオン透過に重要な役割を持つアミノ酸を同定した。
一方、我々の研究室で開発した光感受性カチオンチャネル(mVChR1等)と異なり、アニオンチャネルロドプシンは、総じて膜移行性が悪いことを確認した。今回、検討したアニオンチャネルロドプシンも依然として膜移行性が悪いため、バイオインフォマティクス等を用いて、更なる改善が必要と考えられた。
これまで、膜移行性が悪い場合、オプトジェネティクスタンパク質が小胞体に集積し、細胞毒性を起こす現象が見られた。しかしながら、今回検討したアニオンチャネルロドプシンは、小胞体内への蓄積を起こすことなく、細胞毒性も見られなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
機能予測を用いて開発したアニオンチャネルロドプシンの様々な変異体を作製し、パッチクランプ法を用いて、機能評価を行った。その中で、1アミノ酸の変異によりチャネル活性がなくなることを見出しており、これらの検討から、クロライドイオン透過に重要な役割を持つアミノ酸を同定した。得られた知見を活かし、更にクロライドイオンの通過を増加させるタンパク質のアミノ酸配列等を予測できると考える。従って、得られた結果は次年度以降のタンパク構造予測等に利用し、更なる改善を行えると考える。
チャネルロドプシンの機能は、そのタンパク質の膜への局在化が重要である。この点について、開発したアニオンチャネルロドプシンは、まだ十分といえる状態ではない。しかしながら、既報告のアニオンチャネルロドプシンと比較し、光応答性が高いものであることから、膜局在化を亢進できれば、更に機能の高い光感受性アニオンチャネルロドプシンが得られると予測される。
実験から、開発したアニオンチャネルロドプシンは、1μW/mm2の弱いLED光刺激によっても300pAを超える応答が得られるため、現段階においても有用性の高いものが得られていると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
我々の最終目的は、アニオンチャネルロドプシンを網膜視細胞の保護などに利用することである。視細胞変性前に遺伝子導入を行うことで、視細胞変性を抑制したいと考えている。Roska らは光活性型クロライドポンプeNpHRを視細胞変性前に作らせることで、視細胞変性を抑制することを示した(Roska, Scoence.2010)。Roskaらはこの要因として、変性により興奮伝達能が落ちる視細胞に対しあらかじめ光感受性を付け加えることで伝達経路を再活性化し、生存を助長した可能性を示唆している。しかし、現在のところ、大きな問題としてアニオンを流入させるオプトジェネティクス遺伝子はいずれも光感受性が低く、高い光エネルギーでの光刺激が必要であり、長期的に考えた場合、目的に反してその光刺激は視細胞死を加速させる可能性が高い。
これに対し、我々の開発したアニオンチャネルロドプシンは、1μW/mm2の弱いLED光刺激でもアニオンを流入できる点から、視細胞保護に有用であると考えている。特に、視細胞はUV光に対して脆弱であるために、我々の開発した遺伝子が短波長側に応答しないことは、非常に有用と考えられる。今回、検討したアニオンチャネルロドプシンも依然として膜移行性が悪いため、バイオインフォマティクス等を用いて、更なる改善を行い、光応答感度を改善する予定である。しかしながら、アミノ酸予測等を用いた膜移行効率の改善が難航することも予期される。そのため、現在検討しているアニオンチャネルロドプシンを用いて、視細胞保護に関する検討を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
遺伝子の検討とパッチクランプ解析に予算を使用した。動物での事前試験は準備段階であるため、次年度に行うこととした。そのため、使用額に差額が生じた。次年度行う実験において、執行予定である。
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