2019 Fiscal Year Research-status Report

Drug screening for Retnitis pigmentosa by using reporter knock-in human iPSCs

Research Project

Project/Area Number	19K09977
Research Institution	Keio University
Principal Investigator	本間耕平慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任助教 (80462729)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小澤洋子慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (90265885)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ヒトiPS細胞 / 網膜視細胞 / 網膜色素変性 / ゲノム編集 / ドラッグスクリーニング
Outline of Annual Research Achievements	網膜色素変性症や加齢黄斑変性症などの視細胞変性疾患は、緑内障、糖尿病網膜症に次いで日本国内の主要な失明原因となっている（厚生労働省資料）。これらの視細胞変性疾患では、様々な遺伝子の変異により、網膜で光を感受する視細胞が細胞死を引き起こす。近年の遺伝子解析技術の発達により、これまでに多くの原因遺伝子が特定されているが（RetNetTM：www.sph.uth.edu/retnet/）、未だこれらは全体の一部であり、それぞれの遺伝子変異に対する視細胞死のメカニズムについて明らかではないため、これらを防ぐ治療法は現在存在しない。そこで本研究では、網膜色素変性患者由来iPS細胞レポーターノックインラインを用いることで、疾患視細胞と正常視細胞を詳細に比較し、細胞死のメカニズムを解析、さらには細胞死を防ぐための薬剤をスクリーニングすることを目的とする。申請者らはいくつかの網膜色素変性患者由来のiPS細胞からレポーターノックインラインを作製することに成功した。そしてこれらのラインを分化誘導することによって蛍光たんぱく質GFP陽性の視細胞を得ることができた。これらのGFP陽性の細胞を、蛍光活性化セルソーティング（FACS）で特異的に採取することができ、またライブイメージングによって長期間の観察が可能であることを確認した。また、この系の薬剤スクリーニングへの応用のために、iPS細胞を用いた既存約化合物ライブラリーによるスクリーニングを行い、培養期間、規模、使用方法を検討している。また、網膜色素変性の原因の一つにスプライシング異常が確認されているが、現在これをターゲットにした治療方法を共同研究で進めている。本研究のレポーターノックイン技術を用いることによって治療の効果を特異的に評価することができると考えられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 現在、新型コロナウイルス罹患拡散防止対応のため、iPS細胞の維持培養、分化培養を中止しているが、状況が好転したら再開する予定である。
Strategy for Future Research Activity	今後は、分化培養の再開と、これまでに得られているmRNAサンプルの解析、また、代謝物の解析を行うことによってそれぞれの原因遺伝子に対応する比較を行う。また、これらの解析から得られた視細胞死の系統解析を行うことで、新規治療法の提案を行う。また、既存薬ドラッグスクリーニングにより、網膜色素変性に対する新規有効薬物の探索を行い、前半の解析との比較を行いながら薬物の作用機序についての探索を行う。スプライシング異常の治療方法開発については、現在、すでに疾患iPS細胞を入手しており、レポーターノックインのプロセスを進めていく。
Causes of Carryover	消耗品の使用量等で誤差が出ているが、次年度に分化培養を増加すると考えられるので、それに充当する予定である。