2021 Fiscal Year Research-status Report

Identification of cysteine peptidases that assure complete dipeptide production in periodontopathic bacteria

Research Project

Project/Area Number	19K10045
Research Institution	Nagasaki University
Principal Investigator	根本孝幸長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 客員研究員 (90164665)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小早川健長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 技術職員 (10153587) 根本優子長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 客員研究員 (10164667) 佐々木実岩手医科大学, 歯学部, 教授 (40187133) 下山佑岩手医科大学, 歯学部, 准教授 (90453331)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	歯周病 / 糖尿病 / ペプチダーゼ / DPP7 / DPP4 / ジペプチジルペプチダーぜ / ジペプチド / 歯周病菌
Outline of Annual Research Achievements	歯周病菌Porphyromonas gingivalisはそのエネルギーと炭素源のすべてを外来タンパク質に依存する。その大半をアミノ酸ではなく、ジペプチドの形で細胞内に取り込む。ジペプチド産生酵素として、従来知られていたジペプチジルぺプチダーゼ(DPP)4とDPP7の他に、我々が発見したDPP11（全生物で初）やDPP5（原核生物で初）が存在し、種々のアミノ酸の組み合わせをジペプチドに変換できる。しかし親水性アミノ酸のセリン、スレオニン、グルタミン、アスパラギンに対応できるDPPの報告はなく、事実、歯周病菌はそれら用の合成基質を分解できない。この状況を歯周病菌がどう克服しているかを明らかにすることが本研究の目的である。我々は以前に歯周病菌DPP4がヒトのDPP4/CD24と同様にインシュリンの分泌を誘導する生理活性物質インクレチン(GLP-1とGIP)を分解することを示した（Ohara- Nemoto et al., 2017）。その研究過程で予想外にDPP7が強力なインクレチン分解活性を有することを発見した。この活性は、最初のN末ジペプチドのみを遊離するDPP4とは異なり、GLP-1やGIPのN末端より順次、かつ効率的に分解したが、その仕組みは不明だった。本研究ではその仕組みの解明を目指した。その結果、ペプチド切断点のC末側にあるアミノ酸の存在によって、従来測定されていたジペプチジル-蛍光基質では切断できない親水性アミノ酸-Xaa(Xaa=任意のアミノ酸）も切断可能となるという事実に辿り着いた。本知見により、4種類のDPPの互いに異なる基質特異性によって、歯周病菌は事実上全てのポリペプチドをジペプチドに分解できることが判明した。同時に歯周病菌DPP7が種々の生理活性を分解し、糖尿病を始めとする全身性疾患に影響を与えうると提唱した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本研究の主テーマに関して重要な知見が得られたので、その結果は2022年１月に論文報告した。しかし、新型コロナウイルスの影響によって岩手医大との共同研究が遅延しているためにさらなる研究成果を出せないでいた。そこで研究分担者下山佑准教授（岩手医大）、研究分担者根本優子博士、研究代表者根本孝幸は2022年３月にミーティングを行ってこれまでのデータの分析と今後の計画と分担を話し合った。
Strategy for Future Research Activity	我々はセリンプロテアーゼS46ファミリーに属するDPP7とDPP11に関して、切断点のC末側の存在が活性を上昇させることを、酵素動力学的パラメーターの変化として定量的に証明することができた。一方でセリンプロテアーゼS9ファミリーに属するDPP4やDPP5では基質切断点のC末端側にそのような明瞭な効果はなかった。しかしながらプロテアーゼが切断点の両側のアミノ酸に依存することはあり得る話である。そこで今後は他のぺプチダーゼ、特にエキソぺプチダーゼであるDPP7やDPP11の対極にあるエンドペプチダーゼにも同様の現象があると推定しており、これを検証する。予備実験の結果、トリプシンやトロンビンにはこの効果は見られなかったが、Staphylococcus aureusの産生するグルタミン酸特異的エンドペプチダーゼ(GluV8)にはC末側アミノ酸による強い活性上昇効果が認められた。DPP7やDPP11の場合は酵素発見以降の歴史が浅いため、十分なデータが蓄積していない。一方GluV8の場合は多くの過去の研究結果の蓄積があるためC末端側のアミノ酸の役割に関してもそれらのデータベースを活かした詳細な検討が可能だと考えている。
Causes of Carryover	COVID-19による規制のために国内外で学会発表ができなかったため。また研究補助員の退職に伴い、年度途中で人件費が不要となったため、繰り越し金が発生した。繰り越し金は、学会出張費と新規基質合成費に充当する。