2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K10066
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
佐伯 歩 北海道大学, 歯学研究院, 助教 (70638345)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柴田 健一郎 北海道大学, 歯学研究院, 名誉教授 (50145265)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | インフラマソーム / IL-1β / ジアシルリポペプチドFSL-1 / gasdermin D |
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| Outline of Annual Research Achievements |
IL-1βは細胞内センサーであるインフラマソームにより活性化され、多くの場合、caspase-1依存的なネクローシス様の細胞死であるピロプトーシスにより細胞外へ放出される。我々はこれまで、Mycoplasma salivariumならびにMycoplasma pneumoniaeのNLRP3インフラマソーム活性化物質の一つであるリポタンパク質 /リポペプチドがマウスマクロファージにピロプトーシスを誘導せず、IL-1βの細胞外分泌を誘導することを明らかにした。本研究では、リポペプチドFSL-1がどのような機構で生きたマクロファージにIL-1β分泌を誘導するのかを明らかにすることを目的とした。近年、caspase-1により活性化されたgasdermin DのN末端領域が細胞膜に小孔を形成し、ピロプトーシスが誘導されること、さらに、生細胞からもgasdermin D小孔を介してIL-1βが分泌されることが報告されたことから、まずはgasdermin Dの関与を検証した。FSL-1はC57BL/6マウスより採取した骨髄由来マクロファージにIL-1βの産生を誘導し、本活性はgasdermin Dのノックアウトにより阻害されなかった。さらに本活性は、細胞膜透過性の阻害剤であるpunicalaginにより有意に阻害された。以上のことより、FSL-1により誘導される生きたマクロファージからのIL-1β細胞外分泌は、gasdermin D小孔によるものではなく、細胞膜透過性が関与していることが示唆された。今後、より詳細なメカニズムを明らかにしていく予定である。本研究課題の解明により、未だ不明な点が多く残されているインフラマソームによる炎症制御機構の新たな一面が明らかとなり、多くの重篤な炎症性疾患の新規診断法や予防・治療法開発に寄与することが期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究で、FSL-1により誘導される生きたマクロファージからのIL-1β細胞外分泌は、gasdermin D小孔によるものではなく、細胞膜透過性が関与していることが示唆され、学会発表を行った。今後より詳細なメカニズムを明らかにしていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 細胞死によらないIL-1βの細胞外分泌機構の解明
（1) 細胞膜透過性亢進による分泌：LPSでプライミングしたC57BL/6（B6）マウス由来骨髄由来マクロファージ（BMMs）を FSL-1刺激し、細胞膜の透過性が亢進するかどうかをYo-Pro-1（細胞膜不透過性の蛍光色素）を用いて調べる。（2) exosomeを介した分泌：LPSでプライミングしたB6BMMsをFSL-1で刺激後、反応上清からexosomeを単離し、IL-1βやインフラマソーム関連分子が含まれるかどうかをWB法で調べる。
2. 細胞外pyroptosomeによる炎症増幅機構の解明
（1) pyroptosomeの分離・精製：pyroptosomeをB6BMMsならびにヒトマクロファージ（THP-1細胞）の培養上清からPercollを用いた密度勾配遠心法で分離・精製する。（2) pyroptosomeによるIL-1β産生誘導に、どのようなインフラマソーム関連分子ならびにレセプターが関与しているかを調べる。（3) FSL-1のIL-1β産生誘導活性に及ぼす影響：LPSでプライミングしたB6BMMsを精製pyroptosome存在下あるいは非存在下でFSL-1刺激し、反応上清中のIL-1β量を調べる。（4) 細胞死誘導活性：上記(2)(3)で回収した反応上清中の乳酸脱水素酵素を測定する。（5) 貪食細胞と非貪食細胞に対する応答の違いを調べる。（6) 貪食後の細胞内動態： THP-１細胞をpyroptosome-GFPで刺激し、LysoTrackerならびに共焦点レーザー顕微鏡を用いてタイムラプス観察を行う。（7) In vivoでのサイトカイン産生誘導：B6マウス尾静脈からB6BMMs由来精製pyroptosomeを単独あるいはFSL-1と共存下で接種後、血中サイトカインを調べる。
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