2019 Fiscal Year Research-status Report
Novel modulating mechanisms of homeostasis by oral bacterial exopeptidases
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19K10071
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
根本 優子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 客員研究員 (10164667)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
根本 孝幸 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (90164665)
下山 佑 岩手医科大学, 歯学部, 講師 (90453331)
小早川 健 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 技術職員 (10153587)
佐々木 実 岩手医科大学, 歯学部, 教授 (40187133)
木村 重信 関西女子短期大学, その他部局等, 教授 (10177917)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | DPP4 / 歯周病 / 糖尿病 / インクレチン / 血糖値 / 生理活性ペプチド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯周病原細菌は全身疾患のリスクファクターとなる可能性が示唆され，特に重度歯周炎に関連する‘red complex’菌種であるPorphyromonas gingivalisは2型糖尿病，急性冠症候群血栓，慢性関節リウマチ，アルツハイマー病のリスクファクターとされている。実際，歯周病と2型糖尿病との関連は多くの疫学研究で示され，また，歯周病治療によってHbA1c値が低下することが報告されている。我々はP. gingivalisを含む歯周病原細菌が全身疾患に関与する分子機構を明らかにすることを目的として本研究を実施した。
成人性歯周炎の主たる原因菌であるP. gingivalisは，栄養素としてアミノ酸を取り込み，細菌増殖のエネルギー源とし，同時に全ての細胞構成要素をアミノ酸代謝を中心として産生するという特徴がある。本菌は細胞外のタンパク質を分解するプロテアーゼ（ジンジパイン）に加えて，ペプチドのN-末端側から2つのアミノ酸の繋がりであるジペプチドを遊離する複数種類のジペプチジルペプチダーゼ(DPP)，およびその他の共同的に働くエキソペプチダーゼを発現している。これまでに我々は，歯周病原細菌エキソペプチダーゼのなかで，DPP4のみは細菌および哺乳類で発現しており，細菌DPP4はヒトDPP4と同様の酵素活性を有しており，膵臓からのインスリン分泌を誘導するインクレチンペプチド[glucagon-like peptide-1(GLP-1), glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP)]を分解して，高血糖を助長することを見出した。本年度は，P. gingivalis，Tannerella，Bacteroides属菌のDPP4，DPPX組換え体を発現し，それらの酵素活性を蛍光標識合成ペプチド基質で測定し知見を得た。また，インクレチン分解能についてMALDI-TOF MSを用いて検討した結果，組換えDPPXはGLP-1，GIPを高効率で分解した。また，グルコース経口投与マウスモデル実験を実施し，DPP投与により，高血糖時間が延長する結果を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
P. gingivalisを含む複数種類由来のDPP4, DPPXをPCRクローニングし，大腸菌発現ペプチドを構築した。これらの酵素をC末端ヒスチジンタグ付きタンパクとして発現精製した。各種のMCA基質を用いて酵素活性を測定し，酵素活性の特性を明らかにした。また，インクレチンを含む生理活性ペプチド分解について，MALDI-TOF MS解析を行った結果，歯周病菌DPPXは高効率でインクレチンを分解することを明らかにした。さらに，種々のペプチド基質についての分解について検討を続けている。動物実験では，酵素標品を低温下でPBSに透析し，滅菌した後，使用する必要がある。しかし，タンパク質標品の溶解性は低温透析処理により低下し，酵素の種類毎に収量が大きく異ることが判明した。発現効率や精製過程での収量を含めて種々の検討を行い，動物実験に用いることができる酵素標品を決定し，グルコース経口投与マウスモデル実験を実施した。歯周病菌であるPrevotella intermediaのペプチダーゼ活性についての検討も行い，新規のArg特異的なジペプチダーゼを見いだし，その酵素学的特性，基質特異性について明らかにした。また，DPPによって産生されるジペプチドの菌体内への取り込み機構について解析を行い報告した。
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| Strategy for Future Research Activity |
各種類のDPPをIPTGインダクションによって大腸菌XL1-Blue株で発現し，菌体を溶菌後，ヒスチジン特異的Talonアフィニティークロマトグラフィーで精製する。同様に歯周病菌DPP4やその他のエキソペプチダーゼを調製する。これらの精製酵素標品を用いて，各種類のMCA合成基質ペプチドの分解活性を測定し，酵素活性の特性についての解析を継続的に推進する。さらに，マウスモデル動物実験での血糖調節についての解析を継続し，血糖値測定，血中インスリン，活性型GLP-1濃度の測定をELISAで行う。GLP-1, GIPを含む生理活性ペプチド分解についても，精製酵素標品を用いて解析を行う。ジペプチド取り込み機能についてはレサズリンを用いた還元力の解析と遺伝子欠失株を用いた解析結果を統合して，歯周病菌でジペプチド取り込みに関与するトランスポーターを明らかにする予定である。
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| Causes of Carryover |
２篇の論文発表に係る追加支出を2020年度に割り当てるため。
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