2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of new therapeutic agents for diabetic complications including periodontal disease
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19K10079
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
大橋 晶子 日本大学, 歯学部, 助教 (00571019)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 浸透圧 / テトラヒドロビオプテリン / 輸送体 / 血管障害 / 一酸化窒素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糖尿病性の血管障害は一酸 化窒素合成酵素(eNOS)の機能不全を主因とする。活性酸素・窒素種(ROS, RNS)による過酸化 脂質などが蓄積し，肝臓や腎臓を含む末梢血管系の不可逆的な障害が進行する。eNOS機能不全の主因は内因性の補因子テトラヒドロビオプテリン(BH4)が酸化型のBH2に置き換わることである。これに対してBH4の投与が試みられているが，BH4投与では，組織・細胞で酵素的なBH4酸化がおこり，BH2の増加が伴うため，実用化できていない。BH4の細胞への 流入の制御により，BH4の過剰な酸化を抑制できると考え，本研究では，細胞内へのBH4の取り込みを担う『輸送体』を同定し，同時にその特異的阻害剤を探索する。
令和元年度では，培養細胞におけるBH4の輸送体特性(基質濃度依存性，ATP感受性，金属イオンの効果，類似化合物による競合阻害)を観察し，これをもとに候補輸送体の絞り込みを行った。その結果，(1)BH4の細胞膜を介した輸送は浸透圧に感受性を示し，低張溶液中においてBH4の輸送が著しく上昇すことを示した，さらにこの浸透圧感受性の輸送は，(2)BH4のサルベージ経路前駆体であるジヒドロビオプテリンやセピアプテリンも基質とすること，および(3)既にビオプテリンを輸送することが知られている平衡型拡散輸送体(ENTs)や有機陰イオン輸送体(OATs)の代表的な阻害剤には感受性がないことが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究計画では，培養細胞におけるBH4輸送の解析と，データベース検索により候補となる輸送体を絞り込んだ後，培養細胞において候補となる輸送体の発現解析および，候補輸送体のBH4輸送能の検討を行う予定であった。今回観察された浸透圧感受性のBH4輸送には，温度刺激，機械刺激，浸透圧やpHなどの物理・化学的な刺激で活性化されるtransient receptor potential (TRP)チャネルが関与すると考えられる。しかし，TRPはイオンチャネルであり，複素環化合物であるBH4を直接輸送するとは考えにくいことから，浸透圧による刺激により活性化されたTRPによってBH4輸送が促進されたと考えられる。このように，BH4の細胞膜輸送のメカニズムが当初想定していたものに比べて非常に複雑であったために，当初の計画より遅れが生じた。
TRPには6つのサブファミリー(TRPCs，TRPVs，TRPMs，TRPA，TRPPs，TRPMLs)が知られている。現在は，この内のどのTRPがBH4輸送に関わるのかを，既に報告されているTRP阻害剤やアゴニストの効果を観察している。また，CaイオンがTRPs活性化に関与することが知られていることから，細胞内/外のCaイオンの枯渇が，BH4輸送活性化にどのような影響を与えるかを検討している。また，浸透圧によって調節されるBH4輸送体そのものの同定についても改めて検討を行う必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞へのBH4輸送のメカニズムを解明することで，BH4の過剰な酸化，すなわちBH2/BH4比の上昇なしにBH4の標的組織への補充を実現させることを目的とし，前年度に引き続き，BH4輸送の促進にかかわるTRPsと，BH4輸送体の同定をそれぞれ行う。
TRPsの同定については，薬剤への感受性から候補となるサブファミリーを絞り込み培養細胞における発現解析を行う。ついで，同定されたTRPsによるBH4輸送活性の促進がBH2/BH4比とNOS活性に与える影響を，ヒト由来内皮細胞を用いて検討する。
他方，BH4輸送体の同定については，低張溶液中，すなわち輸送活性が促進された条件下で再度輸送特性の観察を行った後，研究計画のとおり，候補輸送体を絞り込み，候補輸送体の発現解析，および輸送体の機能解析を行う。同時に，輸送体阻害剤の選定とその効果の検討を行う。BH4，ジヒドロビオプテリン，およびセピアプテリン，または，既にビオプテリン化合物の輸送活性が示されている輸送体基質から類似化合物を選定し，この化合物のBH4輸送への阻害効果とBH2/BH4比への効果をそれぞれ評価する。
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| Causes of Carryover |
(理由)
培養細胞におけるBH4の輸送特性の検討に時間を要したために，候補輸送体の発現解析，および輸送体の機能解析が遅れている。このため，分子生物学的試薬(ベクター，酵素，siRNAmcRNA合成キットなど)の購入が当初の計画よりも少なくなったと考えられる。
(使用計画)
令和元年度に引き続き，細胞膜を介したBH4輸送メカニズムの解明のため，(1)培養細胞において観察されるBH4輸送特性の検討，および阻害剤やアゴニストを用いたTRPsの同定をおこない，(2)候補となった輸送体，およびTRPsの発現解析を行ったのち，(3)これら輸送体がNOS活性，およびBH2/BH4日に与える影響を観察する。これらを行うために，NOS活性測定に必要な抗体，NO測定用化合物などのNOS関連試薬の購入，輸送体の同定必要なプライマー，siRNA，発 現ベクターなどの分子生物学的試薬の購入，輸送体の絞込，および候補輸送体の阻害に必要な輸送体関連試薬の購入，細胞の培養のために必要 な培養容器などの消耗品を購入，BH4輸送体の発現を確認するために必要な抗体・スライドグラスなどの免疫染色関連試薬の購入，およびBH4輸送活性の解析に使用するHPLC/蛍光検出器の 運用維持に関わる費用が必要となる。また，研究成果の発表のため，学会への参加費，論文発表のための英文校閲料が必要である。
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[Presentation] Tetrahydrobiopterin Regulates Developmental Differentiation of Brown Adipose Tissue2019
Author(s)
Minamino H, Fujita Y, Oguri Y, Goto T, Ohashi A, Furuya F, Isomura N, Kawarasaki S, Kawada T, Hasegawa H, Inagaki N
Organizer
79th American Diabetes Association
Int'l Joint Research
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[Presentation] Tetrahydrobiopterin Is Required for Brown Adipose Tissue Development and Differentiation2019
Author(s)
Minamino H, Fujita Y, Oguri Y, Goto T, Ohashi A, Furuya F, Isomura N, Kawarasaki S, Kawada T, Hasegawa H, Inagaki N
Organizer
The 11th Scientific Meeting of the Asian Association for the Study of Diabetes
Int'l Joint Research
