2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K10092
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
福間 裕 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 技術職員 (50253688)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
筑波 隆幸 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (30264055)
坂井 詠子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (10176612)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 破骨細胞 / 新規輸送因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
破骨細胞は骨吸収時に波状縁というユニークな膜構造からリソソームのプロトンやタンパク質分解酵素を放出する。私達はこのユニークな膜構造を持つ破骨細胞への成熟化が進むと発現が増大する遺伝子の中から新規タンパク質であるRab44を同定した。Rab44は膜輸送の制御を行っていると予測されるが、同遺伝子をノックダウンした破骨細胞は活性化・巨大化した。逆にRab44を過剰発現した破骨細胞では活性化が抑制され、エンドゾームの粒子数が増大した。本研究ではさらにRab44の分子機構を探るため、in vitro 解析としてリソソームと細胞膜との結合おけるRab44機能の解明を行う。さらにin vivo での解析としてRab44のノックアウトマウスを作製し、骨組織・骨代謝の変化を解析する。
１）リソソームと細胞膜との結合おけるRab44機能の解明
同定した結合分子はドッキングに必要な因子かプライミングに必要な因子の2種類に分類できる可能性がある。従って結合分子をドッキング因子かプライミング因子に分類し、破骨細胞での機能について明らかにしている。
２）Rab44欠損マウスの作製
破骨細胞や免疫細胞特異的な組織分布を示す。Rab44の機能を生体レベルでの解析を行う。既に理化学研究所生体ゲノム工学研究チームに作製されている。受精卵に注入したsgRNA/Cas9 が標的遺伝子の片方もしくは両方のアレルを切断すると変異マウスが得られる。両アレルが破壊された場合には，欠損ホモマウスとなる。卵割したのちにCas9が標的配列を切断するとモザイクマウスが生まれるため、区別できるまた以降で述べる様々な病態モデルを使ってRab44の欠損による影響を調べる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Rab44は細胞内の膜輸送を制御する分子スイッチであり、Rabはエフェクターと呼ばれる結合分子と協調的に働くことで小胞輸送やオルガネラの動態を制御する。しかし、Rab44のエフェクター分子は明らかになっていない。そこで本年度はRab44タンパク質と結合するタンパク質を同定を試みた。このことにより、なぜ破骨細胞ではリソソームがRab44依存的に分泌されるのかの分子基盤が解明される。
・Rab44の結合分子の同定
Rab44は細胞内の膜輸送を制御する分子スイッチである。我々は破骨細胞ではリソソームがRab44依存的に分泌されることを示したが、その結合分子は明らかになっていない。そこでRab44タンパク質と結合するタンパク質を酵母ツーハイブリッド法、免疫沈降法、プルダウン法、プロテオーム解析等により同定している。現在、詳細に解析を進めている。このことにより、なぜ破骨細胞ではリソソームがRab44依存的に分泌されるのかの分子基盤が解明される。
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| Strategy for Future Research Activity |
Rab44による破骨細胞での骨吸収機構の解明と新しい病態解明
Rab44の破骨細胞の多核化のメカニズムを膜輸送や小胞輸送という切り口から明らかにできる可能性がある。また遺伝子異常により、破骨細胞機能が活性化されることから、歯周病やリュウマチなど骨代謝疾患の新しい病態の解明に繋がる可能性がある。
・Rab44遺伝子欠損マウスでの骨組織・骨代謝の変化
Rab44は破骨細胞では発現しているが、骨芽細胞では発現していない。Rab44ノックダウン破骨細胞が活性化していることから、Rab44遺伝子欠損マウスは骨粗鬆症を呈することが予測される。そこで胎生期マウスあるいは生後数日後のマウスの透明骨格標本を作製する。アルシアンブルー染色で青色に染まった軟骨組織とアリザリンレッドで赤色に染まった石灰化硬組織の範囲を比較し、マウス個体レベルでの硬骨形成の比較を行う。
さらに成長したマウスの大腿骨、椎骨等のX線解析を行い、固定後脱灰パラフィン切片や非脱灰樹脂切片を作製し、HE染色、TRAP染色を行い、骨形成を比較する。またカルセインを2回投与し、非脱灰樹脂標本を作製し骨組織形態計測を行う。またμCT解析により骨量、海綿骨数、海綿骨厚を測定する。
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| Causes of Carryover |
未使用金額が626874円ある。これはノックアウトマウスがまだ十分に繁殖していないためである。本年度は解析を進めるため、消耗品費を使用する。
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