2020 Fiscal Year Research-status Report
デンチャープラーク微生物叢の真菌と細菌間相互作用に関わる分子種の探索
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19K10099
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| Research Institution | Aichi Gakuin University |
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Principal Investigator |
西川 清 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (50340146)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 細菌真菌間相互作用 / カンジダ / 口腔細菌 / メタ16Sゲノム解析 / 相関検定 / デンチャープラーク / 誤嚥性肺炎 / レプトトリキア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本学附属病院に通院中の義歯装着患者から採取したデンチャープラークとデンタルプラークの計46検体について、それらを構成する全細菌属と真菌カンジダ・アルビカンスの量比を求めるために、次世代シーケンサーを用いたメタ16Sゲノム解析と定量的リアルタイムPCR解析を行った。
その結果、デンタルプラークと比べデンチャープラークで構成比が高い細菌群として、レンサ球菌、乳酸桿菌、ロシア、コリネバクテリウムの４属を見出した。また、誤嚥性肺炎の起炎菌として報告されている７つの細菌属が、義歯表面に高頻度かつ比較的高い構成比で定着していることも発見し、義歯の清掃状態が誤嚥性肺炎発症の重要なリスク因子であることを定量的に裏付けた。
更に、カンジダ・アルビカンスと各細菌属間の量的な相関関係をスピアマンの順位相関検定により解析した。その結果、乳酸産生菌である乳酸桿菌やビフィズス菌など３菌属がカンジダと正の相関を示した一方、日和見細菌で偏性嫌気性のレプトトリキア属、歯周病関連菌、心内膜炎関連菌など１２菌属が負の相関を示すことを見出した。これらの中で、カンジダに対し最も高い負相関性を示し、かつ健康なヒトに対する病原性が低いレプトトリキア属は、病原真菌カンジダ属の増殖を抑制する何らかの生理活性物質を発現している可能性があり、臨床応用の観点から興味深い。以上の研究成果を論文にまとめ、学術雑誌に投稿・受理された。
この研究成果を受けて、in vitroでの真菌－細菌間相互作用を検討するために、カンジダ・アルビカンスとレプトトリキア属との嫌気的条件下における共培養条件を固形培地および液体培地それぞれで検討したところ、一般的には好気条件下で培養されるカンジダが、ある培地成分の濃度を変更することで嫌気条件下でも十分増殖可能となることを見出し、両者の共培養系確立に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
カンジダ・アルビカンスとの相互作用を検討すべき口腔常在細菌種として、量的に最も負相関を示し、かつ健康なヒトに対して低病原性のレプトトリキア属を見いだせたことと、カンジダ・アルビカンスとの嫌気的条件下における共培養系を確立できたところまでは、当初の計画通り順調に進められた。
しかし、予備実験として固形培地上で共培養を行ったところ、カンジダコロニーの増殖がレプトトリキアコロニーと接触することで阻害される、いわゆるコンタクト・インヒビションの現象が観察されず、固形培地上では明らかなカンジダ抑制効果の有無が判別できなかった。
そこで培養条件を液体培地に変更し、単独培養と共培養とで増殖曲線を描いて比較する手法により、固形培地上では判別不能な弱い増殖抑制ポイントを見出すことに実験計画を修正した。液体培地を用いた共培養系での各菌の増殖度計測方法を考案・検討する作業に時間を費やしたため、当初計画していた分子レベルでの網羅的な発現比較解析を年度内に着手することができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
属レベルでの細菌16S群衆解析と相関解析により、カンジダ・アルビカンス構成比に対して高い負相関を示しかつヒトに対する病原性が弱い条件を満たす細菌属としてレプトトリキアを見出した。今後は、カンジダとレプトトリキアの共培養系とカンジダ単独培養系の増殖度比較解析から、果たしてレプトトリキアにカンジダ抑制能があるのかを検討していく。
これに先立ち、カンジダ・アルビカンスとの1対1共培養に供するレプトトリキアを種レベルで決定しなければならない。以下の2つの方法を並行して進める計画である。
第１の方法では、これまでに取得した次世代シーケンスデータを元に、16SrDNA参照データベースを変更して群衆解析を再実行する。これにより多くの細菌の分類解像度が属レベルから種レベルに向上したとの報告があり、レプトトリキア属についても種レベルでの構成比が明らかになることが期待される。
第2の方法は、公的機関から入手可能な菌株に絞り、その中から共培養に供するレプトトリキア種を決定することである。先の次世代シーケンス解析でレプトトリキア属の量的存在が明らかとなったプラーク検体由来のメタゲノムを用い、菌種特異的なプライマーを設計の上、定量的リアルタイムPCR解析を実行し、プラーク中で優勢かつカンジダと負相関を示す条件に合致するものを代表菌種として選定する。
上記いずれかの方法でレプトトリキアの代表菌種を決定後、カンジダ・アルビカンスとの共培養系に供し、カンジダ単独培養時と比べて増殖抑制が認められるポイントの有無を、増殖曲線の比較から探索・判定する。増殖抑制ポイントが認められた場合には、当初予定の分子レベルでの発現比較解析に移行し、そこで特異的に発現するmRNAやタンパク質を網羅的解析法にて同定する。
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| Causes of Carryover |
世界的なCOVID-19感染拡大状況下で、発注後に納品時期が未定となった輸入を要する消耗品が生じ、結局発注中止と代替品への変更発注を余儀なくされたなどの事情により、年度末ぎりぎりまで正確な使用金額が確定できなかった。ただし、令和３年度への繰越額は令和２年度繰越額を下回っており、当初予定の予算執行はほぼ達成されている。繰越金は令和３年度の物品購入費や解析委託費用等に充当する計画である。
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